DH5α感受態(tài)細(xì)胞是一種常用于質(zhì)?？寺〉母惺軕B(tài)細(xì)胞，其φ80lacZ△M15基因的產(chǎn)物可與pUC載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)108 cfu/µg。recA1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒 DNA的提取。

天根DH5α感受態(tài)細(xì)胞(CB101-01)是采用大腸桿菌DH5α菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒(隨產(chǎn)品配備，濃度為0.1 ng/µl)檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)108cfu/µg，-90~-65℃保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

操作步驟：

1.取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中。

注意: 一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100µl，可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。應(yīng)注意所用DNA體積不要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。以下實(shí)驗(yàn)以100µl感受態(tài)細(xì)胞為例。

2.向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA(100μl的感受態(tài)細(xì)胞能夠被1ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和)，輕彈混勻，在冰浴中靜置30min。

3. 將離心管置于42℃水浴中放置60-90 sec，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3 min，該過程不要搖動(dòng)離心管。

注意:此步驟也可將離心管置于室溫進(jìn)行，時(shí)間不需十分準(zhǔn)確，夏季或室溫較高時(shí)，可放置5-8 min左右，如果室溫較低，可延長(zhǎng)時(shí)間至8-15 min左右。條件允許建議使用42℃C熱激方法。

4.向每個(gè)離心管中加入900μl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45min(150rpm)，目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

5.將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16 h。

注意:涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板;反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過離心(4000rpm,2 min)后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。(涂布剩余的菌液可置于4°C保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板)

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