小動物活體成像技術是指利用一套非常靈敏的光學檢測系統(tǒng)，在不損傷動物的前提下，對活體狀態(tài)下的生物體內(nèi)的組織、細胞和分子水平的定性和定量研究的技術。通過這項技術可以非侵入式、直觀地觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉移，感染性疾病的發(fā)展過程、特定基因的表達變化等生物學過程。

活體光學成像技術，主要包括生物發(fā)光（Bioluminescence）與熒光（Fluorescence）兩種技術。生物發(fā)光技術是用熒光素酶（Luciferase）基因標記細胞或者DNA，而熒光技術則是應用熒光蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）標記細胞或蛋白等研究對象。其中生物發(fā)光技術因其操作簡單，背景噪音低，靈敏度高，結果直觀等優(yōu)點，在腫瘤，分子互作及信號傳導等研究中得到了廣泛應用。

熒光素酶報告基因

報告基因（Reporter Gene）：通常指可編碼某種蛋白或酶，其表達產(chǎn)物容易被檢測，并且能與內(nèi)源性背景蛋白相區(qū)別的基因，通過它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控。

理想的報告基因必須具備哪些條件？

1.編碼的表達產(chǎn)物必須與細胞內(nèi)源性的所有基因相區(qū)別，編碼產(chǎn)物的活性不受宿主細胞的干預。

2.有快速簡便、經(jīng)濟、靈敏的檢測方法，且重現(xiàn)性好、結果可靠，測量數(shù)據(jù)應該有較寬的線性范圍。

3.細胞內(nèi)的其他基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測，同時報告基因的表達也不改變宿主細胞的生理功能。

常用的熒光素酶有哪些？

熒光素酶（Luciferase）是自然界中能發(fā)出熒光的酶的統(tǒng)稱。他們可以通過酶促反應催化底物產(chǎn)生自發(fā)熒光。熒光素酶因其便于檢測和靈敏度高等特性常作為報告基因被廣泛用于生化檢測實驗中。其中應用泛的是螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。

螢火蟲熒光素酶的發(fā)射波長560nm,在體內(nèi)會紅移至610nm,組織穿透性更好，適用于動物內(nèi)臟等較深部位的組織成像。優(yōu)點包括底物不產(chǎn)生本底光源，底物干凈，對照組的設置就相對容易。但缺點也有，相對分子質(zhì)量較大，在62-64kDa，不適宜轉一些小細胞或細菌，影響表達效果；同時，需要鎂離子及ATP的參與才能發(fā)生酶促反應產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，一些能量代謝，對鎂離子或ATP特別靈敏的實驗，要注意檢測手段對結果波動的影響。但普通的腫瘤或干細胞檢測，則不影響檢測效果。

海腎熒光素酶的發(fā)射波長480nm，此波段小鼠的皮膚、毛發(fā)、血液、臟器對光的吸收較強，因此其產(chǎn)生的藍光組織穿透能力較弱，適用于動物淺表組織成像；優(yōu)點是相對分子質(zhì)量較小，可用于一些小的細胞及細菌，發(fā)光過程不消耗ATP及鎂離子。但缺點是底物會有一定的本底光源，底物打入小鼠后，也會有微弱的信號，此時對照組的設置要求相對就嚴格一些。

根據(jù)實驗目的，合理設計我們的實驗方案，選取合適的熒光素酶，建立穩(wěn)定的細胞系及轉基因動物后，注射適當?shù)纳锇l(fā)光底物即可進行活體成像設備的拍攝研究。

活體成像生物發(fā)光的標記原理

活體動物生物發(fā)光成像，是將熒光素酶基因整合到細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素（luciferin），即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。當?shù)孜镞^量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關性，檢測方便，定量準確，在生物技術領域有非常廣泛的應用。

常用的底物給藥方式有腹腔注射和尾靜脈注射

腹腔注射：迅速分布全身，并穿過包括大腦在內(nèi)的血液組織屏障；注射底物后10～20 分鐘進入成像平臺期，發(fā)光信號達到峰值并逐漸減少；2h后信號消失，不可檢測。

尾靜脈注射：可提供更高的發(fā)光強度，5～10倍的高信號，但是注射難度較高，代謝快。底物注射后約2min進入信號峰值，約30min后信號消失。

建議：第一次使用熒光素酶底物成像，或者更換新品牌底物，需要進行預實驗，觀察底物在何時達到峰值。確定注射熒光素底物和成像之間的最佳延遲，然后將此時間用于所有實驗，以標準化成像數(shù)據(jù)。生物發(fā)光信號的動力學具有組織依賴性。建議每5-10min對動物進行一次成像，最多40min，為每個新建模型創(chuàng)建一個發(fā)光動力學曲線。常見信號峰值時間點在10-15min左右，熒光反應發(fā)光一般在30min后衰減，3h后消失。

逐典D-熒光素鉀鹽

逐典D-熒光素鉀鹽，其優(yōu)點在于純度高（HPLC>=99%）,經(jīng)驗證的優(yōu)異的生物發(fā)光性能，以及高溶解度。游離形式的熒光素溶解度較差，而鉀鹽形式能做到較好的水溶性，逐典開發(fā)的高純度D-熒光素鉀鹽溶解度可達40mg/ml以上。活體成像試驗中，建議注射量在150mgD-熒光素鉀鹽/kg鼠體重（如對于體重為10g 的小鼠，需要注射100 μL 以提供1.5 mg D-螢光素鉀鹽）。

IVIS Lumina III 小動物活體成像平臺

IVIS Lumina III是Revvity推出的第三代小動物活體光學二維成像平臺。該系統(tǒng)秉承了前幾代IVIS系列共有的作為業(yè)內(nèi)金標準的高靈敏度生物發(fā)光二維成像性能，并且進一步優(yōu)化了熒光二維成像性能，將濾光片標準配置數(shù)量增加至26個，同時引入了作為熒光多光譜成像金標準的純光譜分析技術（CPS），使得Lumina III成為同時擁有生物發(fā)光及熒光二維成像金標準的高性能活體成像平臺。

主要特點

•高靈敏度生物發(fā)光二維成像

•高性能熒光二維成像,配備高品質(zhì)濾光片及光譜分離算法，可實現(xiàn)自發(fā)熒光扣除及多探針成像

•基于切倫科夫輻射原理的放射性同位素成像