按照《GB 5413.20-2022 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定》中LC-MS方法，對(duì)膽堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了分析。

國(guó)標(biāo)方法中使用Amide色譜柱，本實(shí)驗(yàn)使用等效HILIC型PC色譜柱（磷酸膽堿鍵合型HILIC色譜柱）進(jìn)行了分析，由于CAPCELL CORE PC色譜柱保留能力更強(qiáng)，考慮整體分析時(shí)間，以及蛋白樣品可能在初始比例有機(jī)相中析出等問(wèn)題，我們將初始有機(jī)相百分比降低至80%進(jìn)行了分析。

如圖1所示，膽堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為3.0 min，峰型良好。

同時(shí)我們按照國(guó)標(biāo)方法中的要求，對(duì)膽堿系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品（0.010 -0.200 mg/L）進(jìn)行分析，得到良好線性結(jié)果，r=0.9979，如圖2所示。

方法檢出限為0.18 mg/100g，滿足方法檢出限要求。

圖1  標(biāo)準(zhǔn)品分析結(jié)果

【色譜條件】

色譜柱：CC PC S2.7; 2.1 ×100mm

流動(dòng)相：A：10 mmol/L甲酸銨，甲酸調(diào)節(jié)pH為5.0

流動(dòng)相：B：乙腈

流動(dòng)相：B%  80%(0min) - 80%(1min) - 60%(3min) - 60%(5min) - 80%(5.1min) - 80%(8min)

流動(dòng)速：0.3 mL/min

溫動(dòng)度：40 ℃

檢動(dòng)測(cè)：LC-MS; ESI; 104.1>60.0(CE 22 DP 80); 104.1>45.0(CE 26 DP 80)

濃動(dòng)度：0.3 mg/mL

進(jìn)樣量：2 µL

圖2  線性分析結(jié)果

按照國(guó)標(biāo)中19.1樣品前處理方法，對(duì)液態(tài)牛奶樣品進(jìn)行了前處理，進(jìn)樣分析，得到結(jié)果如圖3所示，牛奶樣品中含有膽堿量為1.08 mg/100g。

圖3 牛奶樣品分析結(jié)果

【色譜條件】

色譜柱：CC PC S2.7; 2.1 ×100mm

流動(dòng)相：A：10 mmol/L甲酸銨，甲酸調(diào)節(jié)pH為5.0 

流動(dòng)相：B：乙腈

流動(dòng)相：B%  80%(0min) - 80%(1min) - 60%(3min) - 60%(5min) - 80%(5.1min) - 80%(8min)

流動(dòng)速：0.3 mL/min

溫動(dòng)度：40 ℃

檢動(dòng)測(cè)：LC-MS; ESI; 104.1>60.0(CE 22 DP 80); 104.1>45.0(CE 26 DP 80)

濃動(dòng)度：0.3 mg/mL

進(jìn)樣量：2 µL

樣品制備：稱取2.5 g試樣，用溫水溶解后， 轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，冷卻至室溫，用水定容混勻。吸取1 mL樣液于50 mL比色管中，加入1 mol/L的鹽酸溶液10 mL，搖晃均勻，超聲振蕩5 min。樣液在70 ℃水浴中加熱3 h，冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至5.0， 轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，用水定容，混勻。然后用流動(dòng)相A稀釋10倍后，經(jīng)0.22 µm水性濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

（1）在進(jìn)樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于該分析方法初始比例為高比例乙腈，高比例乙腈有可能導(dǎo)致樣品中剩余的少量蛋白在流動(dòng)相條件中析出，堵塞色譜柱造成柱壓升高。可考慮在樣品配置后，使用初始比例流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行最終稀釋進(jìn)樣。

（2）HILIC系色譜柱日常使用維護(hù)與反相色譜柱有較大差別，需注意HILIC色譜柱的沖洗和保存。

綜上所述，使用CAPCELL CORE PC S2.7; 2.1 mm i.d.×100 mm色譜柱，按照《GB 5413.20-2022 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定》中第三法液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法，能夠獲得良好檢測(cè)結(jié)果，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。