作者將N末端的人RNase H1蛋白通過表面修飾的方法固定在原子力顯微鏡針尖上。這種蛋白可以結(jié)合RNA/DNA雜交雙鏈，稱為雜交結(jié)合域（hybrid binding domain, HBD），在這里作者使用結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的DNA探針而不是RNA來檢測mRNA。在實(shí)驗(yàn)中，修飾后的探針用于檢測一種腦特異性miRNA，miR-134。這是一種能夠調(diào)節(jié)脊椎生長和樹突生成的腦特異性miRNA。

為了驗(yàn)證特異性的識(shí)別，作者首先將全部RNA從細(xì)胞中提取出來，并將其與固定在玻璃片上面積大約15-20平方微米的探針DNA斑點(diǎn)雜交。使用布魯克ForceRobot原子力顯微鏡²進(jìn)行單分子力曲線測試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)粘附力大約在20pN上下，解離距離大約3.8nm。通過對(duì)比修飾后探針與單鏈ssDNA，雙鏈dsDNA和雙鏈dsRNA斑點(diǎn)以及經(jīng)過RNase H處理后的斑點(diǎn)間的力曲線，可以確認(rèn)這是一種特異性結(jié)合。在實(shí)驗(yàn)中，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)AFM掃描像素點(diǎn)尺寸在4nm時(shí)，miR134的粘附力圖為一個(gè)由34個(gè)像素點(diǎn)組成的團(tuán)簇，并且在大多數(shù)像素點(diǎn)上觀察到特異性結(jié)合的概率不低于40%。這一團(tuán)簇可以被擬合為一個(gè)橢圓，等效圓半徑14nm。這一尺寸與結(jié)合構(gòu)型中的分子尺寸一致。通過是否產(chǎn)生粘附力團(tuán)簇、特異性結(jié)合產(chǎn)生的概率即可判斷原子力顯微鏡探針是否檢測到了目標(biāo)mRNA分子。

根據(jù)估計(jì)，單個(gè)miRNA種類在細(xì)胞中的平均拷貝數(shù)約為500。為了確保能在單個(gè)細(xì)胞中識(shí)別目標(biāo)miRNA，作者使用FluidFM探針³制備了直徑為3-8 μ m的探針DNA斑點(diǎn)，通過將合成miR-134溶液（10-100 aM，40 μL中含有240-2400個(gè)拷貝）孵育在其中一個(gè)斑點(diǎn)上來評(píng)估識(shí)別效率。作者在每一個(gè)樣品的每一個(gè)斑點(diǎn)中的三個(gè)任意位置記錄粘附力數(shù)據(jù)并取平均值，計(jì)算了每個(gè)斑點(diǎn)上識(shí)別到的miR-134數(shù)目。通過線性回歸，作者計(jì)算出DNA斑點(diǎn)上miR-134的識(shí)別效率為78%。

在驗(yàn)證了這一方法可以成功識(shí)別體外RNA后，作者進(jìn)一步將這一方法應(yīng)用于單個(gè)海馬體神經(jīng)細(xì)胞上。使用進(jìn)行修飾后可以與miR-134互補(bǔ)的原子力顯微鏡探針，作者在神經(jīng)元體的隨機(jī)位置進(jìn)行了力曲線測試。作者使用布魯克NanoWizard原子力顯微鏡⁴對(duì)MAP2免疫染色標(biāo)記的神經(jīng)元在AC模式下進(jìn)行成像，并選擇了三個(gè)位置進(jìn)行粘附力測試（100×100像素，1.0×1.0 μm2），在同一位置得到細(xì)胞熒光圖像、原子力顯微鏡圖像與力曲線數(shù)據(jù)（圖4）。在神經(jīng)元體上，每個(gè)圖像中可以觀察到2-4個(gè)團(tuán)簇。RNase H處理后同一區(qū)域中團(tuán)簇的消失，這同樣證實(shí)了觀察到的粘附力曲線是具有特異性的。在固定的神經(jīng)元上，只有當(dāng)探針DNA與目標(biāo)RNA雜交時(shí)才觀察到合格的簇，而當(dāng)互補(bǔ)RNA或亂序DNA雜交時(shí)則不會(huì)觀察到團(tuán)簇，這與在玻璃片上DNA探針斑點(diǎn)上獲得的結(jié)果一致，即這一miRNA/DNA雜交是特異性檢測。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種方法的準(zhǔn)確性與特異性，作者還分析了在固定的神經(jīng)元上膜去極化誘導(dǎo)的miR-134表達(dá)變化。在固定前，海馬神經(jīng)元（DIV7）通過KCl（40 mM）處理2小時(shí)以誘導(dǎo)去極化。在受刺激的神經(jīng)元（1.0×1.0 μm2）的區(qū)域內(nèi)平均觀察到了9.9個(gè)團(tuán)簇，而在未受刺激的對(duì)照神經(jīng)元中僅檢測到了2.7個(gè)簇（見圖5）。使用共聚焦顯微鏡觀察c-Fos的表達(dá)增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了KCl刺激神經(jīng)元的效果。雖然需要進(jìn)一步研究了解AFM探針的壓入深度和樣品制備的影響，但這種直接的AFM粘附力圖像觀察到的簇?cái)?shù)增加與在DNA探針斑點(diǎn)上通過提取出RNA進(jìn)行宏觀評(píng)估的結(jié)果一致。同一細(xì)胞上不同位置和同一條見下不同細(xì)胞間miR-134數(shù)量變化很小，證明了其在DIV7海馬體神經(jīng)元內(nèi)是全局性表達(dá)的。

作者通過建立了一種基于原子力顯微鏡的粘附力成像新型miRNA定量方法。這種方法的靈敏度足以在單個(gè)細(xì)胞中分析特定miRNA的拷貝數(shù)，而無需修飾、逆轉(zhuǎn)錄或擴(kuò)增。同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)miRNA的原位測試。結(jié)合AFM的高分辨率特性，這種方法同樣適用于神經(jīng)元的其他區(qū)域，如樹突和突觸。如果借助快速原子力顯微鏡，將能夠高效地可視化單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)表面。此外，使用固定細(xì)胞和組織的切片能夠檢查細(xì)胞的內(nèi)部和特定的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)。這種新的分析方法為理解miRNA的生物學(xué)作用及其細(xì)胞間變異提供了新的途徑。在生物樣品中檢測少量的miRNA生物標(biāo)志物將使得這種方法能夠作為一種可行的癌癥診斷工具。