非天然氨基酸（ncAAs）是一類不受遺傳密碼子約束的特殊氨基酸，它們具有空間構(gòu)型和化學(xué)性質(zhì)，通過將它們精準(zhǔn)地結(jié)合到蛋白質(zhì)中，我們可以為蛋白質(zhì)賦予新的化學(xué)、物理和生物活性。近年來，隨著生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域的快速發(fā)展，非天然氨基酸在生物學(xué)研究、藥物開發(fā)以及醫(yī)學(xué)診斷等方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(CFPS)作為一種創(chuàng)新的蛋白質(zhì)表達平臺，極大的促進了人工蛋白質(zhì)的表達，通過整合ncAAs，開發(fā)了許多靈活的方法，可顯著提高ncAAs的整合效率。

今天就和大家分享Front Bioeng Biotechnol期刊上名為“Emerging Methods for Efficient and Extensive Incorporation of Non-canonical Amino Acids Using Cell-Free Systems”的文獻。

無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）已成為在特殊應(yīng)用中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的有效方法。通過消除細(xì)胞膜屏障和細(xì)胞活力約束，CFPS比體內(nèi)蛋白質(zhì)表達有明顯的優(yōu)勢：1.CFPS的開放性，使得研究人員可以精確地操縱系統(tǒng)中分子；2.無需考慮細(xì)胞活性，有毒試劑和難以表達的蛋白質(zhì)可以在CFPS中使用，甚至可以應(yīng)用一些沒有生物相容性的反應(yīng)條件；3.無需使用活細(xì)胞，生物安全可以得到保證。因為CFPS系統(tǒng)的這些特點讓其在ncAA整合中也具有顯著優(yōu)勢，包括能處理有毒ncAAs、簡化后續(xù)反應(yīng)流程以及避免細(xì)胞內(nèi)整合的限制等。

然而ncAAs在CFPS中的整合過程會受到內(nèi)生競爭影響，為了精確合并ncAAs，需重新分配特殊密碼子。雖然研究人員已對終止密碼子和有義密碼子進行了重新分配，但ncAAs復(fù)合物與內(nèi)源性生物分子間的密碼子競爭仍會導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤或截斷。

圖1:CFPS系統(tǒng)制備和ncAAs合并中的內(nèi)源競爭的示意圖

密碼子的競爭，會嚴(yán)重影響ncAAs整合的效率。目前，消除競爭的方法包括基因組工程、蛋白質(zhì)消除、tRNA操作和氨基酸替代。

圖2:消除ncAAs競爭的不同策略

1.基因組工程

2.蛋白質(zhì)消除策略

由于開放式反應(yīng)環(huán)境可以直接控制，CFPS系統(tǒng)相比于體內(nèi)翻譯系統(tǒng)更靈活。各種消除競爭策略只有在CFPS系統(tǒng)中才有可能。其中從CFPS系統(tǒng)中消除蛋白質(zhì)的競爭是一個重要的消除策略，通過操縱蛋白質(zhì)水平來保持對細(xì)胞生長至關(guān)重要的蛋白質(zhì)活性，同時從CFPS系統(tǒng)中去除可能產(chǎn)生競爭的蛋白質(zhì)。

CFPS系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)消除策略對于提高蛋白質(zhì)合成效率和控制產(chǎn)物純度至關(guān)重要。通過選擇性去除或失活特定蛋白質(zhì)，如RF1，可以優(yōu)化CFPS系統(tǒng)的性能，并促進nAAs的插入，從而擴展蛋白質(zhì)的功能和應(yīng)用范圍。這些策略的實施依賴于基因工程和蛋白質(zhì)工程的進展，以及針對特定蛋白質(zhì)的定制化消除方法的開發(fā)。

3.tRNA的操作

4.替換氨基酸

圖3:新型ncAA僅用于CFPS

圖4:體外氨基?；椒ㄅcCFPS相結(jié)合

CFPS作為設(shè)計遺傳密碼的強大平臺，特別是其高效整合ncAAs的能力，可以通過基因組工程、肽釋放因子消除、tRNA操作和氨基酸替代等多種策略來優(yōu)化人工蛋白質(zhì)的合成效率和產(chǎn)量。這些策略使得多個密碼子可以被重新分配給不同的ncAAs，無需內(nèi)源性競爭，為人工蛋白質(zhì)合成提供了更大的靈活性。CFPS在多個新興領(lǐng)域如抗體藥物、蛋白質(zhì)標(biāo)記和肽基材料中的應(yīng)用潛力巨大，特別是在酶活性改善方面的潛力，例如通過ncAAs的整合來模擬或增強酶的磷酸化、甲基化等關(guān)鍵修飾。研究人員可以通過選擇合適方法，將CFPS高效整合ncAAS中，并激發(fā)ncAAs技術(shù)和應(yīng)用的未來突破。

綜上所述，CFPS在ncAAs方面具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，CFPS結(jié)合ncAAs將在藥物研發(fā)、材料科學(xué)、生物學(xué)研究和合成生物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

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