50×TAE緩沖液的用途與配制方法及使用注意事項(xiàng)！

一、知識(shí)背景

50×TAE緩沖液是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的核酸電泳緩沖液，特別是在DNA或RNA的瓊脂糖凝膠電泳中發(fā)揮著重要作用。50×TAE緩沖液是一種常用于核酸電泳的緩沖系統(tǒng)，由Tris-acetate和EDTA組成。TAE的全稱為四胺四乙酸，其化學(xué)名稱為N-[2-羥基-1，2-乙二胺基]-三乙酸，分子式為C10H14N2O8，分子量為290.24。TAE緩沖液主要用于DNA的提取、純化和檢測(cè)過(guò)程中的電泳分離。

在DNA提取過(guò)程中，TAE緩沖液可以有效地穩(wěn)定DNA，防止其降解。同時(shí)，由于其較低的離子強(qiáng)度和較高的pH值（約為8.3），TAE緩沖液可以有效地抑制DNA酶的活性，從而保護(hù)DNA免受降解。此外，TAE緩沖液還常用于RNA的提取和純化過(guò)程中的電泳分離。

二、基本信息

中文名稱：50×TAE緩沖液

英文名稱：50×TAE Buffer

主要成分：三羥甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)、乙二胺四乙酸(EDTA)

作用：在凝膠電泳中維持合適的pH，使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA或RNA分子的遷移

三、特點(diǎn)與用途

廣泛應(yīng)用：TAE緩沖液是生物學(xué)中使用泛的核酸電泳緩沖液之一。

遷移率快：雙鏈線狀DNA在TAE緩沖液中的遷移率較其他緩沖液快約10%。

分離效果好：電泳大于13kb的DNA片段時(shí)，TAE緩沖液能取得更好的分離效果。

回收方便：回收DNA片段時(shí)也易用TAE緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳。

四、配制方法

50×TAE緩沖液的配制方法如下（以配制1L為例）：

稱量Tris 242g，Na2EDTA·2H2O 37.2g于1L燒杯中。

向燒杯中加入約600ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?/span>

加入57.1ml的冰乙酸，充分?jǐn)嚢琛?/span>

加去離子水定容至1L后，室溫保存。

五、使用注意事項(xiàng)

稀釋使用：50×TAE緩沖液為濃縮液，工作濃度為1×，使用前需用蒸餾水或超純水稀釋50倍。

保存條件：常溫運(yùn)輸和保存，有效期一般為12個(gè)月。

沉淀處理：若產(chǎn)品出現(xiàn)沉淀析出，可置于37℃水浴中使其溶解，不影響使用。

更換工作液：由于TAE緩沖液的緩沖容量較小，建議及時(shí)更換工作液，長(zhǎng)時(shí)間電泳（如過(guò)夜）時(shí)不可選用，除非有循環(huán)裝置使兩極的緩沖液得到交換。

六、應(yīng)用

50×TAE緩沖液可以用于HIV-1新重組株CRF55＿01B的T細(xì)胞表位變異特征研究：

研究通過(guò)橫斷面分析比較CRF55＿01B與當(dāng)前主要流行的CRF01＿AE、B、CRF07＿BC亞型毒株在病毒Gag、Pol、Nef蛋白的T細(xì)胞表位的變異,尤其是已知具有明確保護(hù)作用的HLA限制性T細(xì)胞表位的變異情況,分析氨基酸變異對(duì)病毒復(fù)制能力的影響,并明確CRF55＿01B亞型病毒二代重組斷點(diǎn)與氨基酸多態(tài)性及T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)系,以此解析CRF55＿01B亞型病毒的生物學(xué)特點(diǎn),并為疾病進(jìn)展評(píng)價(jià)及免疫治療奠定基礎(chǔ)。

研究方法：

1、研究對(duì)象本研究選取深圳市2015-2020年基因型耐藥檢測(cè)確定為CRF01＿AE、CRF07＿BC、CRF55＿01B和B亞型病毒的新診斷199例HIV感染者,經(jīng)Western Blot確認(rèn)HIV感染,納入研究時(shí)未服用過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病物,通過(guò)親和力實(shí)驗(yàn)判定為近期感染（6個(gè)月內(nèi)）。收集感染者血漿標(biāo)本,血漿-80℃冷凍。本項(xiàng)目招募的所有參與者均獲得書面知情同意書。

2、血漿HIV-RNA提取和gag、pol、nef全長(zhǎng)基因巢式PCR擴(kuò)增根據(jù)QIAamp Viral RNAMini Kit試劑盒的說(shuō)明書從血漿中提取HIV-RNA。采用自行設(shè)計(jì)引物巢式PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行g(shù)ag、pol、nef基因片段擴(kuò)增。

3、PCR產(chǎn)物的鑒定及測(cè)序使用50×TAE緩沖液配制1.0%瓊脂糖凝膠,根據(jù)gag、pol、nef基因片段大小選擇2000bp、10000bp DNA ladder作為定量Marker,每孔加5μl的第二輪PCR產(chǎn)物,120V的電壓下電泳30 min。在Ultra-Violet Product凝膠分析系統(tǒng)紫外模式下觀察有無(wú)目的條帶。獲得目的條帶的PCR產(chǎn)物由華大基因公司（中國(guó)）直接測(cè)序。

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