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利用CFPS進(jìn)行nnAA定點(diǎn)插入，巧妙實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性PTM
蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（Post-translational modification，PTM）極大地?cái)U(kuò)展了蛋白質(zhì)組的多樣性，對蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能至關(guān)重要。常見的PTM類型包括磷酸化、糖基化、乙?；?、泛素化、甲基化等。
在進(jìn)行PTM結(jié)構(gòu)和功能研究時(shí)，通常需要獲得均一且在特定位點(diǎn)有修飾的蛋白，而這往往是該研究領(lǐng)域的難點(diǎn)。其原因有：
1. 許多在大規(guī)模篩選中發(fā)現(xiàn)的修飾，其體內(nèi)進(jìn)行修飾的天然酶是未知的。
2. 天然酶可操控性低，有些修飾酶的底物特異性較廣泛，無法在特定位點(diǎn)獲得所需的PTM而不影響其他位點(diǎn)；而有些修飾酶的底物特異性相對嚴(yán)格，無法在天然位點(diǎn)以外的位置進(jìn)行PTM。
非天然氨基酸選擇性引入PTM
那么，能否不依賴天然酶直接合成具有所需PTM的蛋白質(zhì)呢？通過在蛋白質(zhì)中插入非天然氨基酸（nnAA或ncAA），即可實(shí)現(xiàn)將感興趣的PTM選擇性地引入目標(biāo)蛋白質(zhì)的任意位點(diǎn)。
圖1 通過遺傳密碼擴(kuò)展在蛋白質(zhì)中插入非天然氨基酸[1]
通過插入nnAA引入位點(diǎn)特異性PTM主要有三種方法：
①直接摻入包含目標(biāo)修飾的 nnAA。目標(biāo)蛋白質(zhì)合成后，即具備所需的PTM。
②摻入包含掩蔽PTM的nnAA。翻譯后，可以用（光）化學(xué)方法去除掩蔽基團(tuán)，所得蛋白質(zhì)即可用于后續(xù)研究。
③摻入包含化學(xué)手柄的nnAA，該手柄可通過后續(xù)的生物共軛反應(yīng)引入所需的PTM[1]。
圖2 通過插入各種非天然氨基酸引入PTM[1]
非天然氨基酸引入磷酸化修飾案例
磷酸化是磷酸基團(tuán)與蛋白質(zhì)的可逆連接，是自然界中最重要的翻譯后修飾（PTM）之一，是蛋白質(zhì)功能和分子識(shí)別多樣化的機(jī)制。Javin等人[2]利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)（CFPS），通過在特異位點(diǎn)引入磷酸化絲氨酸（Sep）成功表達(dá)了有活性的人類MEK1激酶，評估了單磷酸化和雙磷酸化形式的位點(diǎn)特異性磷酸化對MEK1活性的貢獻(xiàn)。
首先，研究人員利用來源于大腸桿菌的細(xì)胞提取物構(gòu)建了無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（CFPS）。該大腸桿菌菌株為釋放因子1（RF1）與磷酸絲氨酸特異性磷酸酶（SerB）的缺陷型菌株，且生長過程中表達(dá)了磷酸絲氨酸的正交翻譯系統(tǒng)（Sep-OTS），因此所構(gòu)建的CFPS體系富含磷蛋白合成所必需的OTS成分（即磷酸絲氨酸-tRNA合成酶、tRNASep和 EF-Sep）。
圖3 通過CFPS引入Sep合成磷蛋白[2]
隨后，研究人員利用該CFPS系統(tǒng)在20小時(shí)內(nèi)表達(dá)了在S218和S222位置為絲氨酸的野生型MEK1（MEK1-SS）、在S218或S222處單位點(diǎn)磷酸化的MEK1變體（MEK1-SPS、MEK1-SSP）、以及雙磷酸化的MEK1變體（MEK1-SPSP）。成功表達(dá)不同形式的MEK1后，研究人員通過WB分析驗(yàn)證了全長MEK1及各種變體的產(chǎn)生；通過Phos-Tag凝膠移位分析驗(yàn)證了Sep的存在，并清楚地證明了MEK1的單位點(diǎn)和雙位點(diǎn)磷酸化。最后研究人員通過體外激酶級聯(lián)試驗(yàn)探究了CFPS的單磷酸化和雙磷酸化MEK1變體對ERK2的酶活性。
圖4 磷酸化MEK1變體的體外合成[2]
該研究通過CFPS系統(tǒng)引入磷酸化表達(dá)MEK1之處在于：第一，CFPS系統(tǒng)規(guī)避了nnAA跨膜運(yùn)輸，該研究中MEK1突變體表達(dá)量遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（0.001 mg/mL）[3]；第二，本研究通過CFPS系統(tǒng)可以在沒有融合伴侶的情況下表達(dá)MEK1，不產(chǎn)生可溶性蛋白伴侶的混雜影響。第三，通過在特異位點(diǎn)引入Sep能夠產(chǎn)生單磷酸化形式的激酶，而無需添加丙氨酸突變來抑制第二位點(diǎn)的磷酸化。
CFPS的非天然氨基酸插入天賦
無細(xì)胞蛋白表達(dá)（CFPS）是將細(xì)胞內(nèi)合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等分子機(jī)器提取出來，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板而在沒有活細(xì)胞參與的體外直接合成蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)。
CFPS在非天然氨基酸插入領(lǐng)域具有顯著優(yōu)勢：
（1）無細(xì)胞系統(tǒng)沒有細(xì)胞膜阻礙，規(guī)避了nnAAs跨膜運(yùn)輸?shù)碾y點(diǎn)；
（2）無細(xì)胞系統(tǒng)不受nnAAs以及目標(biāo)非天然蛋白可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用影響；
（3）有利于消除nnAAs插入的內(nèi)源性競爭，提高nnAAs插入效率。
參考文獻(xiàn)：
[1]NIU W, GUO J. Co-translational Installation of Posttranslational Modifications by Non-canonical Amino Acid Mutagenesis. ChemBioChem, 2023, 24(9).
[2]OZA J P, AERNI H R, PIRMAN N L, 等. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications, 2015, 6.
[3]Park, H.-S., 等. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science, 2011, 333.
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