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氯膦酸二鈉脂質(zhì)體Clodronate Liposomes·清除腦巨噬細(xì)胞解決方案
氯膦酸二鈉脂質(zhì)體Clodronate Liposomes是相對(duì)于抗體，基因敲除小鼠等手段而言目前來(lái)說(shuō)成熟（Nico Van Rooijen教授90年代開(kāi)發(fā)和后期荷蘭liposoma公司商業(yè)化生產(chǎn)），可靠，經(jīng)濟(jì)且廣泛使用的一種有效的巨噬細(xì)胞清除工具。脂質(zhì)體包裹氯膦酸鹽通常用于清除巨噬細(xì)胞群，因?yàn)樗坏┍痪奘杉?xì)胞吞噬，然后被溶酶體酶消化，游離氯膦酸鹽在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累，當(dāng)濃度超過(guò)一定閾值時(shí)就會(huì)產(chǎn)生功能上不可逆的抑制和細(xì)胞凋亡。由于氯膦酸鹽在血液中的半衰期只有幾分鐘，游離的氯膦酸鹽會(huì)被腎臟迅速清除。借助腹腔，尾靜脈等多種給藥方式實(shí)現(xiàn)不同組織部位中巨噬細(xì)胞的清除。荷蘭liposoma是目前Cell，Nature和Science頂刊發(fā)表的用于體內(nèi)/體外巨噬細(xì)胞清除的氯磷酸二鈉脂質(zhì)體/氯膦酸鹽脂質(zhì)體。
對(duì)于腦部巨噬細(xì)胞，可以參考我們之前的文章，有專門(mén)介紹腦各種類型巨噬細(xì)胞的。常駐小膠質(zhì)細(xì)胞與血管周圍和腦膜巨噬細(xì)胞一起由胚胎卵黃囊前體產(chǎn)生，占所有腦細(xì)胞的10%。氯膦酸鹽脂質(zhì)體通過(guò)腦內(nèi)或腦室注射給藥，主要是掌握腦立體定位注射，可以定點(diǎn)清除海馬，下丘腦等部位巨噬細(xì)胞。北京腦科學(xué)與類腦研究所利用荷蘭liposoma的氯膦酸鹽脂質(zhì)體Clodronate Liposomes清除下丘腦巨噬細(xì)胞的文獻(xiàn)可以聯(lián)系我們索取。
腦巨噬細(xì)胞清除參考模型一
動(dòng)物模型：C57BL/6J小鼠，使用海馬切片培養(yǎng)直接研究小膠質(zhì)細(xì)胞
巨噬細(xì)胞清除方法：在體外試驗(yàn)天數(shù)的第0天和第3天，在培養(yǎng)基中加入0.05 mg/mL Clophosome-A 培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)照組給予等量陰離子脂質(zhì)體對(duì)照加入到培養(yǎng)基中。處理后，切片用加熱的PBS仔細(xì)沖洗三次，并用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。
巨噬細(xì)胞清除結(jié)果：
在氯膦酸處理的培養(yǎng)物中，小膠質(zhì)細(xì)胞被顯著去除(圖A, 3)，而氯膦酸鈉對(duì)神經(jīng)元密度無(wú)影響
腦巨噬細(xì)胞清除參考模型二
動(dòng)物模型：C57BL/6J小鼠
巨噬細(xì)胞清除方法：立體定位注射10ul
巨噬細(xì)胞清除結(jié)果：
腦室內(nèi)的氯膦酸鈉導(dǎo)致血管周圍CD206陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的清除，但不影響小膠質(zhì)細(xì)胞(P2Y12R標(biāo)記，綠色)。用內(nèi)皮標(biāo)記物番茄凝集素(藍(lán)色)觀察血管。
腦巨噬細(xì)胞清除參考模型三
動(dòng)物模型：C57BL/6雄性小鼠(8 ~ 10周齡，23 ~ 25 g)；C57BL/6背景Cx3cr1GFP/+小鼠(雄性，8 ~ 10周齡，23-25 g)
巨噬細(xì)胞清除方法：
Cx3cr1GFP/+小鼠和C57BL/6小鼠，將1 μL的Liposomes 或1 μL的對(duì)照Dil-Lip注射到左紋狀體(距囟門(mén)前方0.8毫米，外側(cè)2.0毫米，深度為3.0毫米)
巨噬細(xì)胞清除結(jié)果：
A.
注射Clodronate liposomes于24小時(shí)開(kāi)始在腦實(shí)質(zhì)中消耗小膠質(zhì)細(xì)胞，注射1 μL Dil-Lip后第1天的一系列腦切片（脂質(zhì)體用紅色熒光染料Dil標(biāo)記）進(jìn)入紋狀體（圖A第一排）或腦側(cè)室（圖A第二排）
代表性圖像顯示，紋狀體注射 Dil-Lip或Clodronate liposomes后不同時(shí)間點(diǎn)Cx3cr1-GFP+小膠質(zhì)細(xì)胞（綠色）的耗竭。（圖A第三、四排）顯示放大后的小膠質(zhì)細(xì)胞圖像。
B.
注射1 μL Clodronate liposomes后紋狀體Cx3cr1-GFP+細(xì)胞的量化數(shù)據(jù)（圖B）。
C.
在Clodronate liposomes注射后的第1、4、7天，用流式細(xì)胞術(shù)分析Cx3cr1-GFP+小膠質(zhì)細(xì)胞。圖中顯示了代表性的點(diǎn)圖，并顯示了紋狀體細(xì)胞群中Cx3cr1-GFP+的百分比。紅色：Cx3cr1-GFP?細(xì)胞群；綠色：Cx3cr1-GFP+細(xì)胞群（圖C）。
D.
圖表顯示注射Clodronate liposomes后紋狀體和皮層中剩余Cx3cr1-GFP+種群的百分比（圖D）。
腦巨噬細(xì)胞清除參考模型四
巨噬細(xì)胞清除方法：海馬切片培養(yǎng)中加入氯膦酸脂質(zhì)體體外18天，濃度0.5 mg/mL（氯膦酸共500 µg），24小時(shí)后，用培養(yǎng)基輕輕洗滌培養(yǎng)物，并給予另一劑量的0.5 mg/mL氯膦酸脂質(zhì)體，再孵育24小時(shí)，此時(shí)再次洗滌培養(yǎng)物，置于新培養(yǎng)基中，孵育7天。第7天，培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞耗盡，準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
巨噬細(xì)胞清除結(jié)果：
小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的代表性細(xì)胞特異性標(biāo)記染色（Iba1，
GFAP, CNPase和NeuN）分別顯示與對(duì)照組（第一排）相比氯膦酸脂質(zhì)體處理（第二排）的切片小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭，且對(duì)其他細(xì)胞類型沒(méi)有影響（比例尺，20毫米）。
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