摘要：小麥抗病基因抑制消減雜交表達(dá)譜的研究過(guò)程和重要發(fā)現(xiàn)。通過(guò)抑制消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了小麥抗病相關(guān)基因的表達(dá)譜文庫(kù)，從中篩選出大量差異表達(dá)基因。對(duì)這些基因的功能分析和表達(dá)模式研究，為深入理解小麥抗病機(jī)制提供了關(guān)鍵線索，同時(shí)也為小麥抗病育種和病害防治策略的制定提供了理論依據(jù)。

一、引言

小麥作為中國(guó)重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)受到各種病害的嚴(yán)重威脅。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，小麥自身發(fā)展出了復(fù)雜的抗病防御系統(tǒng)。然而，要全面解析小麥的抗病機(jī)制，需要深入了解在病原菌侵染過(guò)程中，小麥基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。抑制消減雜交（SSH）技術(shù)為研究這種差異表達(dá)基因提供了一種強(qiáng)大的手段。通過(guò)構(gòu)建在抗病和感病狀態(tài)下小麥基因表達(dá)的消減文庫(kù)，我們能夠挖掘出那些在抗病反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的基因，這對(duì)于揭示小麥抗病的分子基礎(chǔ)和培育抗病品種具有極其重要的意義。

二、材料與方法

（一）植物材料與病原菌處理

小麥品種選擇

選用對(duì)特定病原菌具有不同抗性水平（抗病和感病）的小麥品種作為實(shí)驗(yàn)材料。這些品種在前期的田間試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室接種鑒定中已明確其抗性特征。

病原菌接種與樣本采集

將病原菌（如小麥條銹菌、白粉菌等）按照標(biāo)準(zhǔn)的接種方法接種到小麥幼苗上。對(duì)于條銹菌，采用孢子懸浮液噴霧接種；對(duì)于白粉菌，通過(guò)抖落白粉病菌孢子于小麥葉片表面進(jìn)行接種。接種后，在特定的環(huán)境條件（溫度、濕度、光照等模擬自然發(fā)病環(huán)境）下培養(yǎng)。分別在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)（如 6 小時(shí)、12 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小時(shí)、72 小時(shí)等）采集小麥葉片組織，同時(shí)設(shè)置未接種的對(duì)照樣本。采集的組織立即用液氮速凍，并保存于 - 80℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（二）RNA 提取與質(zhì)量檢測(cè)

總 RNA 提取

使用高質(zhì)量的 RNA 提取試劑盒（如 TRIzol 試劑等）從采集的小麥葉片樣本中提取總 RNA。提取過(guò)程中，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，包括組織研磨、裂解、相分離、RNA 沉淀和洗滌等步驟，以確保獲得高質(zhì)量、無(wú) DNA 污染的總 RNA。

RNA 質(zhì)量檢測(cè)

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的完整性，觀察 28S 和 18S rRNA 條帶的清晰度和比例。同時(shí)，使用分光光度計(jì)檢測(cè) RNA 的濃度和純度，要求 A260/A280 比值在 1.8 - 2.0 之間，以保證 RNA 的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

（三）抑制消減雜交（SSH）文庫(kù)構(gòu)建

雙鏈 cDNA 合成

以提取的總 RNA 為模板，使用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈 cDNA。然后，在特定的反應(yīng)體系中合成第二鏈 cDNA。在雙鏈 cDNA 合成過(guò)程中，加入適量的引物和緩沖液，確保反應(yīng)條件的準(zhǔn)確性，如溫度、時(shí)間等。

抑制消減雜交反應(yīng)

將抗病和感病樣本的雙鏈 cDNA 分別作為 tester 和 driver。首先，對(duì) tester cDNA 進(jìn)行酶切處理，產(chǎn)生粘性末端。然后，將 tester 和 driver cDNA 進(jìn)行兩輪雜交。在雜交過(guò)程中，利用抑制消減雜交技術(shù)的原理，使差異表達(dá)基因在雜交過(guò)程中得到富集。具體而言，通過(guò)設(shè)計(jì)特定的引物和接頭，使得只有在 tester 中特異表達(dá)或高表達(dá)的基因片段能夠在后續(xù)的 PCR 擴(kuò)增中得到有效擴(kuò)增，而共同表達(dá)的基因則被抑制。

消減文庫(kù)構(gòu)建與克隆篩選

經(jīng)過(guò)雜交和 PCR 擴(kuò)增后，將獲得的差異表達(dá)基因片段與合適的載體（如 pGEM - T Easy 載體等）連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)藍(lán)白斑篩選等方法，挑選出含有插入片段的陽(yáng)性克隆，構(gòu)建 SSH 文庫(kù)。

（四）差異表達(dá)基因篩選與鑒定

菌落 PCR 鑒定

從構(gòu)建的 SSH 文庫(kù)中隨機(jī)挑選菌落，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。使用載體特異性引物，擴(kuò)增插入的基因片段。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物的大小，初步判斷插入片段的長(zhǎng)度和多樣性。

斑點(diǎn)雜交與 Northern 雜交

對(duì)菌落 PCR 鑒定有差異的克隆進(jìn)行斑點(diǎn)雜交和 Northern 雜交進(jìn)一步驗(yàn)證。在斑點(diǎn)雜交中，將 PCR 產(chǎn)物點(diǎn)樣于尼龍膜上，與標(biāo)記的探針（如從抗病和感病樣本中提取的 cDNA 探針）進(jìn)行雜交，檢測(cè)基因的差異表達(dá)情況。Northern 雜交則是將總 RNA 進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜，再與標(biāo)記的基因探針雜交，從 RNA 水平更準(zhǔn)確地確定基因的表達(dá)差異。

序列測(cè)定與生物信息學(xué)分析

對(duì)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的差異表達(dá)基因克隆進(jìn)行序列測(cè)定。將獲得的序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如 NCBI 的 GenBank、Swiss - Prot 等）中進(jìn)行同源性搜索和比對(duì)，確定基因的種類和可能的功能。同時(shí)，利用生物信息學(xué)工具分析基因的結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子區(qū)域、保守結(jié)構(gòu)域等信息，預(yù)測(cè)基因在小麥抗病過(guò)程中的作用機(jī)制。

三、結(jié)果

（一）RNA 提取質(zhì)量

成功從接種病原菌和未接種的小麥葉片中提取了高質(zhì)量的總 RNA，瓊脂糖凝膠電泳顯示 28S 和 18S rRNA 條帶清晰，比例正常，分光光度計(jì)檢測(cè) A260/A280 比值符合要求，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了良好的起始材料。

（二）SSH 文庫(kù)構(gòu)建與分析

構(gòu)建的 SSH 文庫(kù)包含了大量的克隆，菌落 PCR 結(jié)果顯示插入片段大小在一定范圍內(nèi)分布，表明文庫(kù)具有較好的多樣性。經(jīng)過(guò)斑點(diǎn)雜交和 Northern 雜交驗(yàn)證，篩選出了一批在抗病和感病小麥樣本中差異表達(dá)顯著的基因。

（三）差異表達(dá)基因鑒定與功能分析

通過(guò)序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析，鑒定出了多種類型的差異表達(dá)基因。其中包括與植物防御反應(yīng)直接相關(guān)的基因，如病程相關(guān)蛋白基因（PR 基因），包括幾丁質(zhì)酶基因、β - 1,3 - 葡聚糖酶基因等，這些基因在抗病小麥中表達(dá)上調(diào)，可能參與了對(duì)病原菌細(xì)胞壁的降解。還有一些與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，如 MAPK 激酶基因、鈣調(diào)蛋白基因等，它們?cè)诓≡秩竞罂赡軈⑴c了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，啟動(dòng)抗病防御反應(yīng)。此外，發(fā)現(xiàn)了部分轉(zhuǎn)錄因子基因，如 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子、MYB 轉(zhuǎn)錄因子等，這些轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控了一系列抗病相關(guān)基因的表達(dá)。

四、討論

（一）SSH 技術(shù)在小麥抗病研究中的優(yōu)勢(shì)與局限性

抑制消減雜交技術(shù)在本研究中有效地富集了差異表達(dá)基因，使我們能夠從復(fù)雜的小麥基因表達(dá)體系中篩選出與抗病相關(guān)的基因。然而，該技術(shù)也存在一定的局限性。例如，SSH 可能會(huì)遺漏一些低豐度但在抗病過(guò)程中具有重要作用的基因，而且對(duì)于一些基因家族成員可能無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分。在后續(xù)研究中，可以結(jié)合其他基因表達(dá)分析技術(shù)，如 RNA - seq，進(jìn)一步完善對(duì)小麥抗病基因表達(dá)譜的研究。

（二）差異表達(dá)基因在小麥抗病機(jī)制中的作用

所鑒定出的病程相關(guān)蛋白基因在植物防御反應(yīng)中的作用已經(jīng)有較多研究，它們通過(guò)降解病原菌細(xì)胞壁成分，抑制病原菌的生長(zhǎng)和侵染。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的變化表明小麥在感知病原菌侵染后，能夠迅速啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活防御相關(guān)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子基因的差異表達(dá)則提示了在小麥抗病過(guò)程中存在復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)結(jié)合到抗病相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄水平。

（三）對(duì)小麥抗病育種的啟示

本研究結(jié)果為小麥抗病育種提供了重要的基因資源和理論依據(jù)?？梢岳矛F(xiàn)代分子育種技術(shù)，如基因編輯技術(shù)，對(duì)鑒定出的關(guān)鍵抗病基因進(jìn)行編輯和改造，培育出具有更強(qiáng)抗病能力的小麥新品種。同時(shí)，通過(guò)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入理解，可以設(shè)計(jì)更合理的育種策略，提高育種效率。

五、結(jié)論

通過(guò)抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建小麥抗病基因表達(dá)譜文庫(kù)，我們成功篩選并鑒定出了一系列在小麥抗病過(guò)程中差異表達(dá)的基因。這些基因涉及防御反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控等多個(gè)方面，為深入理解小麥抗病機(jī)制提供了重要線索。本研究結(jié)果對(duì)于小麥抗病育種和病害防治具有重要的指導(dǎo)意義，為保障小麥產(chǎn)量和品質(zhì)奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)，也為進(jìn)一步研究植物 - 病原菌互作機(jī)制提供了有價(jià)值的參考。未來(lái)的研究可以在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探索這些基因的功能和相互作用，完善小麥抗病的分子機(jī)制模型。