一、引言

腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，傳統(tǒng)的治療方法如手術(shù)、化療和放療在一定程度上改善了患者的預(yù)后，但仍存在局限性?；蛑委熥鳛橐环N新興的治療策略，為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望。然而，基因轉(zhuǎn)染效率和靶向性一直是制約其發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。

超聲微泡技術(shù)作為一種新型的非病毒基因轉(zhuǎn)染方法，具有更好的優(yōu)勢(shì)。超聲微泡是一種微小的氣泡結(jié)構(gòu)，其外殼通常由生物相容性材料構(gòu)成，內(nèi)部填充氣體。在超聲場(chǎng)的作用下，微泡能夠產(chǎn)生一系列的物理效應(yīng)，如空化效應(yīng)、聲流效應(yīng)等。這些效應(yīng)可以使細(xì)胞膜通透性增加，從而促進(jìn)基因進(jìn)入細(xì)胞。此外，超聲微泡還可以通過(guò)表面修飾實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，減少對(duì)正常細(xì)胞的影響。因此，探索超聲微泡在腫瘤細(xì)胞報(bào)告基因轉(zhuǎn)染中的潛力對(duì)于腫瘤基因治療的發(fā)展具有重要意義。

二、材料與方法

（一）材料

細(xì)胞系

選用多種常見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞系，如人乳腺癌細(xì)胞系 MCF - 7、人肺癌細(xì)胞系 A549、人肝癌細(xì)胞系 HepG2 等，這些細(xì)胞系均購(gòu)自正規(guī)細(xì)胞庫(kù)，并在含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的相應(yīng)培養(yǎng)基中，于 37°C、5% CO? 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

試劑

報(bào)告基因質(zhì)粒（如綠色熒光蛋白 GFP 基因質(zhì)粒）、脂質(zhì)體、聚乳酸 - 羥基乙酸共聚物（PLGA）、全氟丙烷氣體、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、熒光定量 PCR 試劑盒、Western blotting 相關(guān)試劑等。

儀器

超聲發(fā)生器（頻率、功率可調(diào)）、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀、離心機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)箱等。

（二）超聲微泡的制備

脂質(zhì)微泡的制備

采用薄膜水化法制備脂質(zhì)微泡。將磷脂（如二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇等）按一定比例溶解于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成均勻的脂質(zhì)薄膜。然后，加入含有報(bào)告基因質(zhì)粒的緩沖液，水化后得到脂質(zhì) - 基因復(fù)合物溶液。將溶液置于超聲發(fā)生器下，在一定功率和頻率下超聲處理一定時(shí)間，使脂質(zhì)形成微泡結(jié)構(gòu)，并將基因包裹于微泡內(nèi)或吸附于微泡表面。

PLGA 微泡的制備

以 PLGA 為材料，采用雙乳液 - 溶劑揮發(fā)法制備微泡。首先，將報(bào)告基因質(zhì)粒溶解于內(nèi)水相中，將 PLGA 溶解于有機(jī)溶劑（如二氯甲烷）中，形成油相。將內(nèi)水相和油相混合，通過(guò)超聲乳化形成初乳。然后，將初乳加入到含有表面活性劑的外水相中，再次超聲乳化形成雙乳液。在攪拌條件下，有機(jī)溶劑揮發(fā)，形成 PLGA 微泡，離心洗滌后備用。

（三）腫瘤細(xì)胞模型的建立

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞消化后，以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N于細(xì)胞培養(yǎng)板（如 6 孔板、24 孔板等）或培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁并達(dá)到一定的匯合度（如 70% - 80%），形成腫瘤細(xì)胞模型，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

（四）超聲微泡介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染分組

設(shè)置不同的轉(zhuǎn)染組，包括超聲微泡 + 報(bào)告基因組、單純報(bào)告基因組（陽(yáng)性對(duì)照，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染報(bào)告基因）、陰性對(duì)照組（僅細(xì)胞，不加轉(zhuǎn)染試劑和基因）等，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

轉(zhuǎn)染操作

對(duì)于超聲微泡 + 報(bào)告基因組，將制備好的超聲微泡懸液（含報(bào)告基因）加入到腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于超聲發(fā)生器的探頭下，調(diào)整超聲參數(shù)（如頻率、功率、輻照時(shí)間等）進(jìn)行超聲處理。超聲處理后，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一定時(shí)間（如 24 - 48 小時(shí)）。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染操作。

（五）轉(zhuǎn)染效率的評(píng)估

熒光顯微鏡觀察

在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如 24、48 小時(shí)），使用熒光顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。計(jì)算熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例，初步評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

流式細(xì)胞術(shù)分析

收集轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例和平均熒光強(qiáng)度，精確評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

（六）細(xì)胞活力檢測(cè)

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK - 8）法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞的活力。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入 CCK - 8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450nm 處的吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞活力，評(píng)估超聲微泡轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞活性的影響。

（七）基因表達(dá)水平檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

提取轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞的總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。使用特異性引物對(duì)報(bào)告基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析，以 β - actin 等管家基因作為內(nèi)參，計(jì)算報(bào)告基因的相對(duì)表達(dá)量，評(píng)估基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

Western blotting

提取轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞的總蛋白，通過(guò) SDS - PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體（如抗 GFP 抗體）進(jìn)行免疫印跡分析。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值，以評(píng)估報(bào)告基因在蛋白表達(dá)水平的變化。

（八）轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

通過(guò)改變超聲參數(shù)（如頻率從 1MHz 到 3MHz、功率從 0.5W/cm2 到 2W/cm2、輻照時(shí)間從 10s 到 60s）、微泡濃度、報(bào)告基因質(zhì)粒濃度等因素，重復(fù)上述轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)方法，觀察轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力和基因表達(dá)水平的變化，以確定最佳的轉(zhuǎn)染條件。

三、結(jié)果

（一）超聲微泡的表征

通過(guò)光學(xué)顯微鏡和粒徑分析儀對(duì)制備的超聲微泡進(jìn)行觀察和測(cè)量，結(jié)果顯示脂質(zhì)微泡和 PLGA 微泡具有良好的球形度和較窄的粒徑分布，平均粒徑在 1 - 5μm 之間，符合在體內(nèi)外應(yīng)用的要求。同時(shí)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳等方法證實(shí)報(bào)告基因質(zhì)粒成功包裹于微泡內(nèi)或吸附于微泡表面。

（二）轉(zhuǎn)染效率評(píng)估

熒光顯微鏡觀察結(jié)果

在熒光顯微鏡下，超聲微泡 + 報(bào)告基因組在轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)即可觀察到部分腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增加。在 48 小時(shí)時(shí)，不同腫瘤細(xì)胞系中的熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例有所不同，但均明顯高于陰性對(duì)照組。

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步定量證實(shí)了超聲微泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率。與陽(yáng)性對(duì)照組（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染）相比，超聲微泡在某些腫瘤細(xì)胞系（如 MCF - 7）中的轉(zhuǎn)染效率相近，而在其他細(xì)胞系（如 A549）中雖略低于陽(yáng)性對(duì)照組，但仍具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

（三）細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果

CCK - 8 法檢測(cè)結(jié)果顯示，超聲微泡轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞活力在轉(zhuǎn)染后 24 - 48 小時(shí)內(nèi)保持在較高水平，與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。這表明超聲微泡轉(zhuǎn)染方法對(duì)腫瘤細(xì)胞的活性影響較小，具有較好的生物安全性。

（四）基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析表明，超聲微泡 + 報(bào)告基因組中報(bào)告基因的 mRNA 表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后明顯增加，與陰性對(duì)照組相比有顯著差異，且在優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件后，表達(dá)量進(jìn)一步提高。

Western blotting 結(jié)果

Western blotting 結(jié)果顯示，在超聲微泡轉(zhuǎn)染后，腫瘤細(xì)胞中報(bào)告基因編碼的蛋白表達(dá)水平與 mRNA 表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致，證實(shí)了超聲微泡能夠有效促進(jìn)報(bào)告基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。

（五）轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)對(duì)超聲參數(shù)、微泡濃度、報(bào)告基因質(zhì)粒濃度等因素的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲頻率為 2MHz、功率為 1.5W/cm2、輻照時(shí)間為 30s、微泡濃度為 [具體濃度]、報(bào)告基因質(zhì)粒濃度為 [具體濃度] 時(shí)，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中可以獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)保持較高的細(xì)胞活力。

四、討論

（一）超聲微泡技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與局限性

超聲微泡技術(shù)在腫瘤細(xì)胞報(bào)告基因轉(zhuǎn)染中表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)。其非病毒載體的特性避免了病毒載體可能帶來(lái)的免疫原性和潛在的致病性問(wèn)題。超聲微泡的靶向性修飾潛力為腫瘤特異性治療提供了可能。然而，本研究也發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定的局限性，如轉(zhuǎn)染效率在某些細(xì)胞系中仍有待提高，超聲參數(shù)的優(yōu)化需要針對(duì)不同的細(xì)胞類型進(jìn)行個(gè)體化調(diào)整等。

（二）超聲微泡的物理效應(yīng)與轉(zhuǎn)染機(jī)制

超聲微泡在超聲場(chǎng)作用下產(chǎn)生的空化效應(yīng)和聲流效應(yīng)是促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵物理機(jī)制?？栈?yīng)能夠使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆或不可逆的小孔，增加細(xì)胞膜的通透性，從而有利于基因進(jìn)入細(xì)胞。聲流效應(yīng)則可以促進(jìn)微泡周圍的基因向細(xì)胞膜附近的運(yùn)輸，提高基因與細(xì)胞膜的接觸機(jī)會(huì)。但這些物理效應(yīng)的強(qiáng)度和作用方式受到超聲參數(shù)的嚴(yán)格調(diào)控，不當(dāng)?shù)膮?shù)可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

（三）不同類型超聲微泡的比較

本研究中制備的脂質(zhì)微泡和 PLGA 微泡在轉(zhuǎn)染性能上各有特點(diǎn)。脂質(zhì)微泡具有較好的生物相容性和易于制備的優(yōu)點(diǎn)，但其穩(wěn)定性相對(duì)較差。PLGA 微泡則具有較好的穩(wěn)定性，但在基因包封率和釋放效率方面可能需要進(jìn)一步優(yōu)化。未來(lái)可以考慮結(jié)合兩者的優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新型的復(fù)合微泡用于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

（四）對(duì)腫瘤基因治療的啟示

本研究結(jié)果為腫瘤基因治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。超聲微泡技術(shù)有望成為一種有效的腫瘤基因轉(zhuǎn)染方法，可用于將治療性基因?qū)肽[瘤細(xì)胞。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和微泡設(shè)計(jì)，提高轉(zhuǎn)染效率和靶向性，有望實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)、更有效的腫瘤基因治療。

五、結(jié)論

綜上所述，超聲微泡在腫瘤細(xì)胞報(bào)告基因轉(zhuǎn)染中展現(xiàn)出了巨大的潛力。通過(guò)合理的超聲微泡制備、優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和對(duì)轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力及基因表達(dá)水平的全面評(píng)估，證實(shí)了該技術(shù)在腫瘤基因治療領(lǐng)域的可行性和應(yīng)用前景。然而，仍需要進(jìn)一步深入研究以克服其目前存在的局限性，推動(dòng)超聲微泡技術(shù)在腫瘤治療中的臨床應(yīng)用。