摘要抗體藥物偶聯(lián)物 (ADCs) 是一類(lèi)快速增長(zhǎng)的生物治療藥物。在生產(chǎn)過(guò)程中，需要監(jiān)測(cè)ADCs 的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQAs)，例如藥物/抗體比率 (DAR) 和聚集體。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)展示了 Agilent Cary 3500 紫外-可見(jiàn)多池分光光度計(jì)在分析 ADCs 的 DAR 和聚集指數(shù)方面的功能優(yōu)勢(shì)，以及在多種溫度下同步測(cè)量多個(gè)樣品的功能。Cary 3500 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)憑借軟件中的自定義方程功能、簡(jiǎn)單的方法和準(zhǔn)確的溫度控制，能夠輕松、可靠地測(cè)定 DAR 和聚集指數(shù)。

前言ADCs 憑借特異性和靶向作用模式，成為制藥公司藥物研發(fā)管線中快速增長(zhǎng)的一類(lèi)生物治療藥物[1]。通過(guò)測(cè)定 DAR 可確定與每個(gè)抗體偶聯(lián)的細(xì)胞毒性小分子的平均數(shù)量，該值對(duì)產(chǎn)品的安全性和有效性有很大的影響，因此通常被視為一種 CQA。研究表明，DAR 還會(huì)顯著影響產(chǎn)物形成聚集體的趨勢(shì)[2]，從而引起免疫反應(yīng)。因此，在開(kāi)發(fā)過(guò)程中分析 ADCs 的 DAR 和聚集體至關(guān)重要。紫外-可見(jiàn)光譜是生物制藥實(shí)驗(yàn)室中的一種常用技術(shù)，常用于可靠、便捷地測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。在本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中，我們證明了只要細(xì)胞毒性小分子含有紫外-可見(jiàn)發(fā)色團(tuán)，并且其最大吸收波長(zhǎng)與抗體支架不同，那么紫外-可見(jiàn)光譜法也可用于測(cè)定ADC 的 DAR[1]。Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)使用簡(jiǎn)單快捷，具有高通量，并且可同時(shí)在四種不同的溫度下為四對(duì)比色皿提供準(zhǔn)確的溫度控制。同步測(cè)量多個(gè)樣品的紫外吸光度可消除不利變量，提高所生成結(jié)果的可靠性。簡(jiǎn)單的方法設(shè)置和定制計(jì)算功能便于用戶使用。Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)與 Agilent OpenLab軟件套裝兼容。在配置 OpenLab 軟件后，它可以支持實(shí)驗(yàn)室遵循 FDA 21 CFR Part 11 法規(guī)認(rèn)證指南。在本研究中，我們展示了 Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在測(cè)定 DAR 和聚集指數(shù)方面的優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)部分儀器Agilent Cary 3500 紫外-可見(jiàn)多池分光光度計(jì)，配有八個(gè)比色皿位置。使用 Cary UV Workstation 軟件（1.0.1284 版）和Cary 3500 多區(qū)控溫附件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，所用參數(shù)如表 1 所示。

赫賽汀及其 ADC 類(lèi)似物購(gòu)自新加坡當(dāng)?shù)氐慕?jīng)銷(xiāo)商。兩種單克隆抗體 (mAb) 樣品均使用 Vivaspin 500 超濾濃縮離心管離心柱 (10 kDa MWCO; Sartorius) 進(jìn)行濃縮。安捷倫矩形 UV 比色皿，10 mm，700 µL，開(kāi)口（貨號(hào) 5061-3391）與 Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)配套使用。新制超純水產(chǎn)自配置 0.22 µm 膜式終端過(guò)濾器 (Merck Millipore)的 Milli-Q Integral 水純化系統(tǒng)。

方法實(shí)驗(yàn)中所用赫賽汀及其 ADC 類(lèi)似物的濃度為 0.5 mg/mL。為了演示 DAR 值的變化，以不同的比例混合赫賽汀及其 ADC 類(lèi)似物（見(jiàn)圖 2 中的表格），并使用 Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。使用 Cary UV Workstation 軟件中的公式 1 計(jì)算 DAR。為了研究溫度對(duì) DAR 的影響，使用多區(qū)控溫附件平行進(jìn)行了四個(gè)實(shí)驗(yàn)（圖 1）。使用 280 nm 處的紫外吸光度，估算得到本實(shí)驗(yàn)中所用的“經(jīng)離心柱濃縮”ADC 的濃度為 25 mg/mL。對(duì)于 25 mg/mL 樣品，用 390 µL 水將 10 µL 樣品稀釋 40 倍。將稀釋后的 400 µL ADC 轉(zhuǎn)移到四個(gè)比色皿中，用 Cary 3500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在 60、70、80 和 90 °C 下同步孵育90 分鐘。在進(jìn)行基線校正后測(cè)量樣品的吸光度，并用公式 1計(jì)算 DAR 值。為了研究聚集效應(yīng)隨時(shí)間的變化，用 390 µL 水將 10 µL25 mg/mL 的樣品稀釋 40 倍。將稀釋后的 400 µL ADC 轉(zhuǎn)移到比色皿中，在 Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中孵育 90 分鐘，并以不同的時(shí)間間隔測(cè)量樣品的吸光度。使用公式 2 計(jì)算聚集指數(shù)。

結(jié)果與討論使用 Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定藥物/抗體比率為了模擬 ADC 的偶聯(lián)過(guò)程，將 ADC 和游離抗體以不同的比例混合，并使用 Cary 3500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定 DAR。圖 2 顯示了 ADC 和未偶聯(lián)抗體混合物的紫外-可見(jiàn)光譜圖。使用公式 2 計(jì)算 DAR。ADC 的藥物分子 DM1 在 252 nm 處有強(qiáng)吸收，與赫賽汀主要發(fā)色團(tuán)在 280 nm 處的吸收不同[4]，如圖 2 所示。正如預(yù)期的那樣，DAR 值隨著溶液中 mAb 和 ADC的比例不同而發(fā)生變化。