在早期的色譜實驗中（Tsvet設計的試驗），疏水性化合物首先從色譜柱中洗脫，然后是極性化合物。這一洗脫順序被稱為正相色譜法（NP）。幾十年后，隨著越來越多的科學家涉足這一領域，其它一些新的分離模式也隨之誕生并用于分離和純化眾多不同基質(zhì)的各種類別的化合物。雖然我很想一一介紹這些新的方法，但今天我們的重點是反相色譜法（RP）。

對于這種分離模式，離子和強極性分析物會先從色譜柱中洗脫，然后是更具疏水性的分析物。此時，化合物的洗脫順序與 Tsvet的試驗中的相反。因此，這一模式被成為“反相”色譜法。

反相色譜法技術的最終目的是將具備不同疏水性的分析物分離。簡單地說，這項工作可以通過以下兩個步驟完成：

1. 使用一個疏水性固定相來保留分析物。

2. 通過對一個有強弱差異的多組分流動相體系進行優(yōu)化，使其成為目標分析物的理想洗脫溶劑。這里面可同時包含有機溶劑和緩沖液。并非所有化合物都具有強酸性或強堿性，但它們可能都帶有極性基團，因此需要較窄的pH范圍來控制它們的電離狀態(tài)。

烴類是疏水性化合物的較好范例，實際上它們屬于油性物質(zhì)。具體而言，直鏈烷烴很適合作為固定相使用。我們應當注意的是，隨著化學鏈中的碳原子數(shù)量的增加，烴類的物理性質(zhì)也會發(fā)生改變—C1到C4為氣態(tài)；C5-C17為液態(tài)；C18及以上為固態(tài)。除了烷烴外，諸如芳香烴和環(huán)烷烴也可作為固定相使用。這些固定相將在其它文章中討論。

C18之所以那么受歡迎，原因之一可能是因為用于鍵合反應的原材料在當時就易于獲得。這一幸運的巧合使人們進一步發(fā)現(xiàn)C18原來如此適合用于色譜分析?？傊@兩個因素都讓C18成為了反相色譜法固定相的砥柱。

下一步就是將烷烴基團（即C18或十八烷基）鍵合到合適的基質(zhì)。硅膠是理想的填料，硅膠顆粒有諸多形態(tài)（球形或不定形）、粒徑（0.9 至10 µm或更大）、孔徑（可高達到1000 ?），而且可以有全多孔和實心核兩種形態(tài)。

在鍵合過程完成之后（該過程的許多細節(jié)都保密），C18配體在分子層級上被連接至硅膠，在硅膠顆?？椎乐械囊话惴植紶顟B(tài)，如下圖所示。

圖 1. C18配體鍵合在硅膠上

圖 2. 硅膠孔表面上的兩個C18配體分子的一般分布

C18固定相的美妙和簡潔之處在于它能夠帶來非常簡單的疏水作用。流動相中的溶質(zhì)在硅膠孔道中移動的過程，它們會因為較弱的疏水（以及范德華力）作用而被C18碳鏈吸引和保留。圖3 給出了該相互作用的示例。

圖 3, C18配體和化合物之間簡單的疏水作用

圖4 顯示C18配體與化合物的苯環(huán)結(jié)構(gòu)及其丙基部分之間有疏水作用。而由于氮上有正電荷，所以C18配體與分子另一側(cè)的氨基之間的吸引力被降到了低值。

用于指示化合物疏水程度的參數(shù)被稱為log P。該參數(shù)與化合物在正辛醇和水中的分配系數(shù)的比值有關。log P值為正則說明目標化合物在正辛醇中的溶解度更高，因此疏水性更強。log P值為負則說明目標化合物在水中的溶解度更高，因此親水性更強。

圖4給出了各類化合物的logP范圍。

圖 4. 各類化合物的log P范圍

在了解這一概念后，如何開展工作就很明確了：要想在 C18色譜柱上保留化合物，那么化合物就必須盡可能為中性或有很高的疏水性。顯然，如果分析物已經(jīng)是中性或不可能帶有電荷的話，那么我們無法對其進行任何操作。

但是，如果是弱酸性或弱堿性化合物，我們就可以使用緩沖液來控制它們的帶電程度。另一個需要在這里用到的化學概念是pKa（和 pKb）。 溶液中的弱酸和弱堿以兩種形態(tài)存在：一種是它們的中性形態(tài)，另一種是它們的去質(zhì)子化形態(tài)（酸）或質(zhì)子化形態(tài)（堿）。在特定的pH值下，這兩種共軛形態(tài)在溶液中的濃度相同。這時的pH值等于該化合物的 pKa和pKb。

下面的圖中（圖5）給出了這兩個pK值以及化合物的疏水性增減和溶液pH變化之間的函數(shù)關系。

圖5. 圖中顯示了弱酸和弱堿共軛物與溶液pH之間的函數(shù)關系

在一般實踐中，建議將流動相的 pH值調(diào)至在分別高于pKb或低于pKa兩個單位，從而確?；衔锼幍男螒B(tài)能使其盡可能在反相模式被保留。當然，任何事情和任何規(guī)律都可能有例外的情況。

到目前為止，我們只介紹了流動相的一個組分，也就是水相部分。我們知道需要利用一些化學性質(zhì)來提高分析物在C18固定相上的保留?，F(xiàn)在，我們要討論的自然就是如何從C18固定相洗脫分析物。

為了克服反相條件下的疏水作用，我們常用的是甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）和四氫呋喃（THF）這三種溶劑。從強度上來看，MeOH最弱，而THF強。這里說的強度是指使用每種溶劑后分析物洗脫的速度。當流動相比例固定，對于單個分析物來說，使用THF相比使用其它兩種溶劑而言洗脫速度要快得多。

但是，如果有多種分析物，那么溶劑強度高并不代表選擇性也會成比例地提高。在以后的文章中，我們會介紹反相色譜法中溶劑選擇性的差別。