SIRT1 activation promotes bone repair by enhancing the coupling of type H vessel formation and osteogenesis

KWS：SIRT1；bone repair；type H vessel formation；osteogenesis

骨缺損可由感染、腫瘤切除或外傷引起，潛在的嚴重后果包括骨折和畸形。目前，自體骨移植、牽引成骨和膜誘導(dǎo)再生技術(shù)是治療骨缺損常用的方法。然而，這些方法可能無法實現(xiàn)令人滿意的愈合，部分原因是血管再生不足。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，H型血管是一種高表達血小板內(nèi)皮細胞粘附分子1（CD31）和內(nèi)皮粘蛋白（EMCN）的特異性毛細血管亞型。通過介導(dǎo)血管生成-成骨耦聯(lián)機制，這種毛細血管亞型可維持骨穩(wěn)態(tài)。此外，H 型血管的缺失也會抑制再生組織中的成骨，其受 H 型血管中骨祖細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)。成骨和血管生成耦聯(lián)涉及多種細胞因子及信號通路，包括血小板源性生長因子BB、低氧誘導(dǎo)因子-1α、Notch信號通路、血管內(nèi)皮生長因子等。然而，目前尚不清楚調(diào)節(jié)因子是否增強了 H 型血管和成骨之間的耦聯(lián)功能以進一步促進骨修復(fù)。

Sirtuin 1（SIRT1）是一種 NAD（+）依賴性脫乙酰酶，調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能并維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)。此外，SIRT1 控制血管生成過程中內(nèi)皮細胞（ECs）的血管生成活性。以往研究報道，SIRT1 激活劑的持續(xù)釋放通過調(diào)節(jié)成骨細胞/破骨細胞分化來恢復(fù)不平衡的骨穩(wěn)態(tài)。然而，SIRT1 是否調(diào)節(jié)骨缺損中的 H 型血管仍有待闡明。

最近，華西-國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心的課題組進行了深入探索，假設(shè) SIRT1 在 H 型血管生成中起調(diào)節(jié)作用，影響骨缺損的愈合。為了檢驗這一假設(shè)，研究人員構(gòu)建了 HUVECs 和成骨細胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)，探討了 SIRT1 的激活或抑制對 HUVEC 血管生成和成骨特性的影響；還評估了 SIRT1 活性對小鼠股骨和下頜骨缺損中 H 型血管和成骨作用的影響。研究結(jié)果確定了通過 H 型血管增強骨修復(fù)的創(chuàng)新且可行的靶點。該研究發(fā)表于Cell Proliferation 期刊題為“SIRT1 activation promotes bone repair by enhancing the coupling of type H vessel formation and osteogenesis”。

首先，CCK8 測定顯示，SRT1720（SIRT1激活劑）處理促進了 HUVEC 增殖，而EX527（SIRT1抑制劑）處理則具有相反的效果。劃痕傷口愈合實驗的結(jié)果表明，SIRT1 激活增加了 HUVEC 遷移，而 SIRT1 抑制則具有相反的效果。定量分析結(jié)果表明，SRT1720 處理時細胞遷移顯著增加，EX527 處理后細胞遷移減少。此外，SIRT1 活化的 HUVECs 在基質(zhì)膠上形成了更多的管狀結(jié)構(gòu)和分支，而抑制 SIRT1 會削弱這種能力。還觀察到 SIRT1 活性水平與 CD31、EMCN 和 VEGF 表達之間存在正相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)表明，激活SIRT1 增強了 HUVECs 的增殖、遷移和血管生成。

隨后，根據(jù)初步結(jié)果，研究人員利用 SRT1720 和 EX527 來檢查 SIRT1 激活或抑制對共培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞血管生成和成骨能力的影響（圖1 A）。

關(guān)于血管生成，觀察到直接共培養(yǎng)導(dǎo)致血管網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)形成，即使在沒有基質(zhì)膠的情況下也是如此。免疫熒光染色顯示，CD31 高表達，表明該網(wǎng)絡(luò)主要由 HUVECs 形成。SIRT1 激活顯著增強了共培養(yǎng)系統(tǒng)中血管網(wǎng)絡(luò)的形成，而 SIRT1 抑制則減少了血管生成（圖1 B、C）。此外，血管生成基因和蛋白（VEGF、CD31、EMCN 和 HIF1A）的表達在 SIRT1 激活后增加（圖1 D、E），且觀察到血管生成因子 SLIT3 的分泌量也顯著增加（圖1 F）。

ALP 和 ARS 染色實驗的結(jié)果表明，SIRT1 激活顯著增強了共培養(yǎng)系統(tǒng)的成骨能力（圖1 G）。此外，成骨因子（ALP、RUNX2、OSX 和 COL1A）的表達水平增加，而抑制 SIRT1 削弱了系統(tǒng)的成骨能力（圖1 H、I）。此外，培養(yǎng)基中 HUVECs 衍生的 TGF-β 濃度顯著增加，SIRT1 激活進一步放大了這種效應(yīng)（圖1 J）。然而，激活或抑制SIRT1 均未觀察到成骨細胞成骨能力的顯著增強。這些數(shù)據(jù)表明，激活SIRT1 在體外促進 HUVEC/成骨細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的血管生成和成骨能力。

圖1   SIRT1激活增強了HUVEC/成骨細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的血管生成和成骨能力。  

免疫印跡試驗結(jié)果顯示，共培養(yǎng)增加了與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）通路相關(guān)的蛋白質(zhì)的磷酸化水平，而在激活或抑制 SIRT1 后，磷酸化水平分別進一步增強或減弱。siRNA 轉(zhuǎn)染后，AKT 在共培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達顯著降低，且血管生成相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達也明顯減少。共培養(yǎng)系統(tǒng)中的血管網(wǎng)絡(luò)數(shù)量也減少了。此外，ALP 染色顯示，在 si-AKT 轉(zhuǎn)染后，共培養(yǎng)系統(tǒng)的成骨能力降低，與成骨相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的表達顯著降低。這說明，PI3K/AKT/FOXO1信號通路介導(dǎo) SIRT1 在 HUVEC/成骨細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中的作用。

為了提供進一步的證據(jù)支持 SIRT1 在骨愈合中的作用，實驗誘導(dǎo)小鼠股骨或下頜骨的骨缺損，然后用 SRT1720 或 EX527 處理（圖2 A）。值得注意的是，激活的SIRT1 在不同時間點顯著促進骨缺損愈合，而抑制 SIRT1 會減緩股骨和下頜骨的這一過程（圖2 B-E）。對于股骨，定量分析顯示，SRT1720處理組在 14 天時僅在骨小梁數(shù)（Tb.N）和骨小梁分離度（Tb.Sp）的骨愈合參數(shù)值上存在顯著差異，其他測量值之間無顯著差異（圖2 C）。此外，下頜骨中骨體積分數(shù)（BV/TV）、Tb.Sp 和骨小梁厚度（Tb.Th）在 SRT1720處理后 14 天也存在顯著差異，而其他指標未觀察到差異（圖2 E）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，HE 和 Masson 的骨缺損三色染色也表明，SRT1720處理促進了新骨的形成和成熟（圖2 F、G）。這些數(shù)據(jù)表明，SIRT1 的激活促進股骨和下頜骨缺損后的骨愈合。

圖2    SIRT1激活促進股骨和下頜骨缺損的骨愈合。

免疫熒光染色顯示，SRT1720 處理顯著促進了股骨缺損中 H 型血管系統(tǒng)的生成，而 EX527 則阻礙了這一過程。在第 7 天和第 14 天之間，定量分析顯示，H 型血管標志物的表達存在顯著差異。對于與骨缺損附近的 H 型血管共表達的成骨因子，如 ALP 和 RUNX2，SIRT1 激活顯著增加了它們的表達，而 SIRT1 抑制則具有相反的效果。

在下頜骨缺損中，SIRT1 活化也與 H 型血管呈正相關(guān)。此外，SRT1720處理組下頜骨缺損中 ALP 和 RUNX2 的表達顯著升高。然而，在 EX527 處理組中，觀察到 RUNX2 表達存在顯著差異，而非ALP 表達。

缺氧誘導(dǎo)因子1a（HIF1A）表達與 H 型血管的形成密切相關(guān)。SIRT1 的激活上調(diào)了骨缺損部位的 HIF1A 表達（圖3 A、B）。在股骨缺損中，HIF1A 表達與 SIRT1 活性之間存在良性關(guān)聯(lián)（圖3 C）。在下頜骨缺損中，HIF1A 表達在初期較高，后期降低，這與在 H 型血管形成中觀察到的變化一致（圖3 D）。此外，SIRT1 激活顯著增加了骨缺損中 p-AKT 和 p-FOXO1 的表達（圖3 E-H）。以上數(shù)據(jù)表明，SIRT1 的激活通過 PI3K/AKT/FOXO1 通路增強骨缺損中 H 型血管和成骨/血管生成因子的耦聯(lián)。

圖3    SIRT1的激活通過AKT-相關(guān)通路促進HIF1A在股骨和下頜骨缺損中的表達。

圖4    SIRT1 的激活增強了 H 型血管生成與成骨的耦聯(lián)，通過 PI3K/AKT/FOXO1 信號通路促進骨修復(fù)。抑制 SIRT1 會削弱血管和骨形成，突出了 SIRT1 在耦聯(lián)過程中的關(guān)鍵作用。

總之，這項研究利用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)和骨缺損模型為 SIRT1 在 H 型血管發(fā)育和骨修復(fù)中的功能提供了重要見解。它還為 SIRT1 激活劑在促進骨愈合中的臨床應(yīng)用提供了更多的實驗證據(jù)。然而，為了充分闡明這些過程的潛在機制并研究 SIRT1 在臨床環(huán)境中的治療潛力，未來有必要進行更深入的研究。

參考文獻：Liu Z, Liu H, Liu S, Li B, Liu Y, Luo E. SIRT1 activation promotes bone repair by enhancing the coupling of type H vessel formation and osteogenesis. Cell Prolif. 2024 Jun;57(6):e13596. doi: 10.1111/cpr.13596. Epub 2024 Jan 11. PMID: 38211965; PMCID: PMC11150139.

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