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疫苗的開發(fā)，從研發(fā)到早期臨床前研究再到商業(yè)化生產(chǎn)、檢測和批次放行，涉及大量的分析與檢測以保證疫苗產(chǎn)品的有效性和安全性。疫苗開發(fā)過程中的生物分析面臨著樣品基質(zhì)、分析物類型以及工作流程效率等方面的挑戰(zhàn)，例如用于分析的疫苗樣本差別很大，分析物的范圍很廣，包括多糖、蛋白質(zhì)和多肽等，這些都必須在不同的基質(zhì)中進行檢測。此外，新一代疫苗涉及越來越多的抗原，例如HPV(人乳頭瘤病毒)疫苗有二價、四價和九價等多種類型，這又大大增加了檢測的復雜性。免疫分析法通常用來測定疫苗的滴度、純度和效力，以及它們在動物和人體中的免疫原性反應(yīng)等，基于多孔板的ELISA免疫分析已經(jīng)成為疫苗生物分析中的黃金標準技術(shù)之一，包括定量抗原表位、評估雜質(zhì)水平和監(jiān)測疫苗開發(fā)中的滴度和免疫原性等。然而，日益緊迫的項目時間表促使研究人員開始尋求疫苗免疫分析性能的改進，包括：
使用更少量的珍貴試劑如疫苗候選分子，以及來自小型實驗動物的樣本
檢測方法可以方便地處理血清和血漿、含鋁佐劑和油乳佐劑的樣品
減少動手操作的時間
減少檢測方法的開發(fā)時間
Gyrolab® 系統(tǒng)為這些需求提供了一個解決方案，并在疫苗開發(fā)中提供了許多額外的獲益。Gyrolab開放的平臺支持對各種分析物、樣品類型和配方進行快速的檢測開發(fā)，并為多種應(yīng)用提供即用型試劑盒。Gyrolab在Bioaffy™ 微流控CD中進行納升級的免疫檢測，最大限度地減少了來自多種基質(zhì)的干擾，而且樣品和試劑消耗量很小，可以滿足最新一代疫苗和小型實驗動物試驗的需要；高通量和自動化模式對多個分析物進行并行分析，大大減少了動手時間，可以快速提供數(shù)據(jù)，滿足具有挑戰(zhàn)性的項目時間表和更快的決策。Gyrolab軟件工作站符合21 CFR 第11部分要求，其開發(fā)的檢測方法及數(shù)據(jù)滿足監(jiān)管環(huán)境要求，并能在制藥廠和CRO之間順利轉(zhuǎn)移。
本文介紹了幾個使用Gyrolab系統(tǒng)提高疫苗研發(fā)性能和效率的應(yīng)用案例，以說明Gyrolab系統(tǒng)在實際使用中的優(yōu)勢。
案例1：在1.5小時內(nèi)檢測血清中的抗原特異性抗體
檢測接種疫苗的受試者的記憶B細胞(MBC)產(chǎn)生的抗體的數(shù)量和質(zhì)量是了解如何誘導終身性保護性抗體的關(guān)鍵。人外周血抗原特異性記憶B細胞的相對頻率一般通過連續(xù)有限稀釋法(serial limiting dilution assay, sLDA)和ELISA分析細胞培養(yǎng)上清液來確定，但這種方法費時費力且耗費大量實驗材料，因此，諾華公司的疫苗和診斷開發(fā)研究人員將ELISA免疫測定法轉(zhuǎn)移到Gyrolab系統(tǒng)上以提高產(chǎn)量。該研究的目標是將奈瑟氏菌抗原 (Neisseria) 與三種佐劑組合后接種小鼠，通過免疫檢測確定小鼠記憶B細胞所產(chǎn)生的IgG亞型。研究人員測試了兩種檢測形式：
直接檢測 (Direct Assay)，
用于評估：①生物素化抗原與Gyrolab Bioaffy微流控CD中鏈霉素親和柱結(jié)合并捕獲特異性IgG的能力；②檢測細胞培養(yǎng)上清液中的抗原特異性抗體的靈敏度；③通過Gyrolab Viewer中的結(jié)合曲線，評估抗體與特定抗原結(jié)合的親和力。
反向檢測(Reverse Assay)，
用于評估Alexa熒光標記的抗原檢測與CD親和柱結(jié)合的特異性IgG的能力。
Direct Assay
圖1. Gyrolab檢測和ELISA在接種奈瑟式菌的受試小鼠B細胞培養(yǎng)上清液中鑒定出相同的陽性和陰性樣本。Y軸為Gyrolab檢測的抗體滴度，ELISA鑒定的陽性樣本以綠色框標記。
圖2. Gyrolab直接檢測法能夠在幾微升的樣品中同時檢測屬于不同IgG亞型的抗體。
與ELISA相比，在Gyrolab系統(tǒng)上進行抗原特異性抗體檢測有很多優(yōu)勢，僅需幾微升的樣品就能分析抗體反應(yīng)的質(zhì)量，即IgG亞型的相對數(shù)量。
案例2：試劑篩選—用于放行檢測的疫苗批次比較
多價疫苗的生物分析越來越復雜，需要開發(fā)大量的檢測方法。因為多價疫苗包含多個抗原，必須為每個抗原成分開發(fā)放行檢測方法以確保劑量和效力，所以每個產(chǎn)品的檢測數(shù)量要乘以抗原的數(shù)量。美國默克公司的疫苗分析開發(fā)小組開發(fā)了一種高度靈活的Gyrolab檢測方法，可以最大限度地減少多價疫苗檢測方法的開發(fā)和試劑消耗 (如標記的檢測抗體等)。該方法是基于固定在Gyrolab Bioaffy CD的鏈霉親和柱上的生物素化山羊抗小鼠IgG，加入分析物特異性捕獲抗體(如小鼠α-PS mAb)之后再加入樣品，然后用第二個分析物特異性抗體(如兔α-PS pAb)檢測被捕獲的分析物，最后用Alexa Fluor® 647標記的驢抗兔抗體進行熒光檢測(圖3)。這種5層“雙夾心”檢測形式無需標記針對特定分析物的試劑，分析物特異性試劑可以很容易地被替代，所以只需要最少的開發(fā)就可以應(yīng)用于多價多糖和多價蛋白質(zhì)疫苗的檢測以及抗血清的批次間差異。
圖3. 5層“雙夾心”Gyrolab檢測形式。PS：多糖分析物
Gyrolab檢測法被用來比較針對三種抗原測試的兩個抗血清批次。使用Gyrolab Viewer軟件模塊可以將CD微通道中親和柱上每個數(shù)據(jù)點的結(jié)合反應(yīng)可視化，這使得數(shù)據(jù)可以與更費時的效力曲線相媲美 (圖4)。
圖4. Panel A：使用熒光強度數(shù)據(jù) (左) 和反應(yīng)曲線 (右) 對抗原A、B和C的抗血清批次進行比較。Panel B：抗原B的Gyrolab Viewer結(jié)合強度曲線圖像，顯示新批次的柱上熒光強度較低，峰拖尾增加，表明該批次的抗體親和力比老批次低。
雖然兩個批次對抗原A的表現(xiàn)相似，但舊批次對抗原B的表現(xiàn)更好，在Gyrolab Viewer中結(jié)合譜圖的峰面積更大，滴定時信噪比更高。新的批次顯示出明顯的柱上熒光拖尾，這表明與抗原的親和力較低。對于抗原C，兩個批次的抗血清都顯示出明顯的拖尾現(xiàn)象，舊批次的抗血清顯示出更多的峰拖尾。滴定時，舊批次的背景較高，信噪比較低。因此，Gyrolab Viewer的可視化結(jié)合譜圖、反應(yīng)曲線和信噪比相結(jié)合為了解抗血清批次提供了寶貴的意見。
默克公司的團隊得出結(jié)論，Gyrolab系統(tǒng)提供了有價值的統(tǒng)計和圖形數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在一起評估時與基于多孔板的檢測數(shù)據(jù)一致，還有快速周轉(zhuǎn)時間、高通量和可視化結(jié)合強度的能力等額外獲益。
案例3：抗原滴度定量動態(tài)范圍擴大到4 logs
疫苗開發(fā)公司需要擴大免疫測定的動態(tài)范圍，以測量吸附在鋁佐劑上的糖蛋白抗原。研究人員將ELISA轉(zhuǎn)移到Gyrolab系統(tǒng)上，將動態(tài)范圍從5-300 mIU/mL擴展到~0.6-40 000 mIU/mL，Gyrolab檢測同時擴展了定量的上限和下限。
圖5. Gyrolab提供了一種強大的檢測方法，在測量抗原滴度時極大地擴展了動態(tài)范圍。
案例4：支持配方開發(fā)的疫苗效力試驗
評估批次間效力的一致性是疫苗質(zhì)量控制的一個重要組成部分。效力試驗可用于穩(wěn)定性研究、發(fā)酵和純化工藝的驗證與優(yōu)化、比較新舊設(shè)施設(shè)施以及評估配方或佐劑變更的效果。
美國默克公司比較了Gyrolab系統(tǒng)與Luminex檢測法在小鼠效力試驗中的表現(xiàn)。該研究涉及小鼠體內(nèi)免疫，將正?；目乖瓨悠废♂尩?-12個劑量濃度范圍。有效劑量 (ED50) 是根據(jù)每個給藥組中50%的小鼠血清轉(zhuǎn)化的最大劑量來確定的，獲得一個ED50值需要多達220個小鼠血清樣本，因此這項繁瑣的工作需要大量的小量樣本。Gyrolab檢測被證明是可靠和穩(wěn)健的，其靈敏度和重現(xiàn)性 (CV<10%) 可與Luminex測定相媲美 (R2 = 0.97)，但操作時間更短，周轉(zhuǎn)時間更快。
圖6. Gyrolab檢測具有高度可重復性，CV<10%
圖7. Gyrolab和Luminex的免疫檢測給出的結(jié)果具有可比性
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