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α-黑素細胞刺激素(α-MSH)負責(zé)觸發(fā)褪黑激素的產(chǎn)生，褪黑激素是人體抵御紫外線(UV)輻射的天然保護。皮膚暴露于紫外線會促進α-MSH的產(chǎn)生；然而，在紫外線暴露前刺激褪黑激素的生物合成可能會預(yù)防紫外線誘導(dǎo)的皮膚癌。
考慮到天然形式的α-MSH在體內(nèi)太不穩(wěn)定而不能作為治療劑施用，人們合成了不同的類似物，其中之一是MT-II(圖1)，一種對酶降解具有高抗性和非凡效力的環(huán)狀類肽。
圖1
由于MI-II的生產(chǎn)往往需要放大到KG級別以滿足臨床需求，因此在實驗室規(guī)模的工藝條件優(yōu)化必須考慮到工藝的可放大性。
Gyros Protein Technologies 提供從實驗室到中試級別的多肽合成儀，幫助從工藝開發(fā)階段順利放大到商業(yè)化生產(chǎn)。
本文案例將討論全自動合成的途徑的優(yōu)化和放大，即線性序列的合成和最終肽的樹脂上內(nèi)酰胺化。在這項工作中， MT-II大規(guī)模合成的優(yōu)化分三個階段進行：
1找到樹脂上環(huán)化的適當(dāng)保護方案；
2使用PurePep Chorus小規(guī)模優(yōu)化合成條件并完成環(huán)化，儀器全自動運行；
3在中試規(guī)模合成器PurePep Sonata+上，利用先前優(yōu)化的條件放大合成MT-II。
01尋找合適的樹脂上環(huán)化保護方案
MT-II的結(jié)構(gòu)在天冬氨酸和賴氨酸之間形成內(nèi)酰胺橋后完成，并且這些殘基需要在樹脂上環(huán)化步驟之前選擇性地去保護。因此，理想的是找到可以伴隨去除的側(cè)鏈保護基團，以最小化脫保護的難度。本實驗第一階段中，使用不同組合的側(cè)鏈保護基團合成MT-II：
1Asp(ODmab)/Lys(ivDde)
2Asp(O-2-PhiPr)/Lys(Mtt)
3Asp(OAlly)/Lys(Alloc)
可以分別用2%肼的DMF溶液、1%TFA的DCM溶液以及鈀-四(三苯基膦)(Pd(PPh3)4)和苯基硅烷(PhSiH)的DCM中溶液同時且選擇性地除去。最終肽的粗純度示于表1中。
表1 不同組合側(cè)鏈保護基團合成的MT-II粗肽純度
當(dāng)比較不同的保護方案時，組合2獲得的粗肽純度最高。然而，F(xiàn)moc-Asp(O-2-PhiPr)-OH相對昂貴，會給后續(xù)的放大生產(chǎn)增加成本。組合1獲得的粗肽純度最低，這歸因于通過用2%肼處理對ODmab和ivDde的去保護效果不佳。此外，盡管組合3呈現(xiàn)出比組合2低得多的粗純度，但經(jīng)過分析這主要與天冬酰胺的形成有關(guān)。通過最小化該副反應(yīng)，可以顯著提高粗肽純度。因此，選定Asp(OAlly)/Lys(Alloc)作為合成MT-II單體并進行下一步優(yōu)化。
02 小規(guī)模優(yōu)化縮合條件
我們首先研究了DIC和OxymaPure用于偶聯(lián)步驟，沒有預(yù)活化(4)和預(yù)活化5分鐘(5)。與組合3一樣，由于天冬酰胺的形成，這些方法導(dǎo)致粗肽純度顯著降低(表2)。因此，MT-II以逐步方式合成：將肽合成至His(His-D-Phe-Arg-Trp-Lys(Alloc)-樹脂)，并用HCTU/NMM(6)或DIC/OxymaPure(7)進行Asp(OAlly)的縮合。在Asp(OAlly)縮合后，進行微切割，其中沒有觀察到天冬酰亞胺的形成。這些片段的粗純度為88.9%。
表2 不同條件下合成MT-II 的純度
線形肽的合成
線性MT-II在PurePep Chorus上以100 μmol規(guī)模在Rink Amide MBHA樹脂(0.35 mmol/g)上合成。在合成之前，將樹脂在DMF中溶脹2 ×10分鐘。脫保護步驟用20%哌啶DMF溶液進行2 × 5分鐘，縮合步驟用5當(dāng)量AA，5當(dāng)量DIC和5當(dāng)量OxymaPure DMF溶液中的(無預(yù)活化-4，或5分鐘預(yù)活化-5)，在室溫下持續(xù)30分鐘。對于片段7和9，Asp(OAlly)和Nle在與5相同的條件下縮合。對于片段6和8，在室溫下，將Asp(OAlly)和Nle與HCTU(5當(dāng)量)和NMM(10當(dāng)量)在DMF中縮合，預(yù)活化時間為5分鐘，單次縮合時間為30分鐘。MT-II的末端胺在室溫下用10% Ac2O的DMF溶液乙酰化30分鐘。
Asp和Lys側(cè)鏈保護基團的選擇性去除：Asp(OAlly)和Lys(Alloc)的脫保護用0.2當(dāng)量Pd(PPh3)4在24當(dāng)量PhSiH的DCM溶液在室溫下洗滌兩次60分鐘，然后用DCM和DMC各洗滌3次。
樹脂上環(huán)化
在室溫下，用吡肟(5當(dāng)量)和DIPEA(5當(dāng)量)在DMF溶液中進行樹脂上環(huán)化60分鐘。
切割
樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌6次，然后干燥20分鐘。每次切割用TFA/EDT/H2O/TIS(94：2.5：2.5：1)的混合物在室溫下進行60分鐘，然后在乙醚中沉淀。
03在PurePep Sonata+ 上放大MT-II 的合成
在PurePep Chorus上小規(guī)模優(yōu)化合成后，得出方案8為最優(yōu)方案。在PurePep Sonata+上大規(guī)模(5 mmol)合成MT-II。
根據(jù)方案8的合成方法和條件，MT-II在PurePep Sonata+ 上合成直至Asp(OAlly)【Fmoc-Asp(OAlly)-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys(Alloc)-樹脂】，之后選擇性除去側(cè)鏈保護基團，用于隨后的樹脂上環(huán)化。環(huán)化后，通過加入Nle和N-末端乙?；瓿尚蛄小０凑赵摬呗?，獲得了粗純度為80.2%的MT-II，這與在 PurePep Chorus上合成0.1 mmol規(guī)模的粗肽純度相當(dāng)。
結(jié)論
● 在PurePep Chorus 多通道多功能全自動合成儀，可以實現(xiàn)小規(guī)模MT-II的合成并對不同合成條件進行探索和優(yōu)化，隨后可順利將最優(yōu)合成條件放到到PurePep Sonata+上進行，合成規(guī)模從100µmol放大到5mmol(增加50倍), 得到的粗肽純度幾乎一致為80.1%。
● 該研究得益于PurePep Chorus的靈活性，MT-II是從頭到尾全自動合成：從線性多肽到選擇性側(cè)鏈脫保護和樹脂上環(huán)化，每一步選擇不同的縮合條件，并且可在合成過程中進行在線微切割提取樣品進行測試，以便根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整條件。在PurePep Chorus上的工藝的可順利轉(zhuǎn)移放大到PurePep Sonata+ 并得到相同的結(jié)果。
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