一、引言

二、材料與方法

（一）實驗材料

1. 大鼠視網膜細胞來源：選取健康的成年 Sprague - Dawley 大鼠，在無菌條件下取出眼球，采用酶消化法分離獲取視網膜細胞，并進行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為含有特定比例的胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素 - 鏈霉素等營養(yǎng)成分的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為 37°C、5% CO? 的細胞培養(yǎng)箱。

2. 轉染試劑與質粒

• 脂質體轉染試劑選用市售的產品（如 威尼德 ），按照產品說明書進行保存和使用前的準備。

• 電穿孔轉染儀采用專門用于細胞電穿孔操作的儀器（如 Bio - Rad Gene Pulser、威尼德），配備相應的電穿孔 cuvette。

• 用于轉染的質粒為攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的真核表達質粒，該質粒在構建過程中經過嚴格的基因克隆技術操作，確保其序列的準確性和完整性。在使用前，對質粒進行大量提取和純化處理，測定其濃度和純度，以保證轉染實驗的準確性。

（二）實驗分組與轉染操作

1. 實驗分組

• 將培養(yǎng)至合適密度的大鼠視網膜細胞隨機分為三組：脂質體轉染組、電穿孔轉染組和未轉染對照組。每組設置多個重復樣本，以確保實驗結果的可靠性和統(tǒng)計學意義。

2. 脂質體轉染操作

• 在轉染前一天，將大鼠視網膜細胞接種于 24 孔板中，使細胞在轉染時達到約 50% - 60% 的匯合度。

• 取適量的脂質體轉染試劑與純化后的質粒 DNA 分別在不同的管中用無血清培養(yǎng)基進行稀釋，然后將兩者輕輕混合，室溫下孵育一定時間（通常為 20 - 30 分鐘），以形成脂質體 - DNA 復合物。

• 將形成的復合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板使復合物均勻分布，然后將細胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在轉染后的不同時間點（如 24 小時、48 小時、72 小時）收集細胞進行后續(xù)檢測。

3. 電穿孔轉染操作

• 同樣在轉染前一天將大鼠視網膜細胞接種于合適的電穿孔 cuvette 中，使細胞密度達到預定要求。

• 將純化后的質粒 DNA 加入到細胞懸液中，輕輕混勻，然后將 cuvette 放入電穿孔轉染儀中。設置合適的電穿孔參數，包括電壓（如 200 - 300 V）、脈沖時間（如 20 - 50 ms）、脈沖次數（如 1 - 3 次）等，根據預實驗和相關文獻報道進行優(yōu)化選擇。

• 啟動電穿孔程序，在脈沖結束后，迅速將細胞轉移至預先準備好的含有完整培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉染后的相同時間點（24 小時、48 小時、72 小時）收集細胞進行檢測。

（三）檢測指標與方法

1. 轉染效率檢測

• 熒光顯微鏡觀察：在轉染后的不同時間點，將細胞置于熒光顯微鏡下觀察。由于轉染的質粒攜帶 GFP 基因，成功轉染的細胞會發(fā)出綠色熒光。通過隨機選取多個視野，計數發(fā)出熒光的細胞數與總細胞數的比例，初步評估轉染效率。同時，觀察細胞的形態(tài)和熒光分布情況，以了解轉染對細胞結構的影響。

• 流式細胞術定量分析：收集轉染后的細胞，用 PBS 緩沖液洗滌細胞兩次，然后重懸于適量的 PBS 中。將細胞懸液上流式細胞儀進行檢測，通過設置合適的熒光檢測通道，對 GFP 陽性細胞進行計數和分析。流式細胞術能夠提供更為精確的轉染效率數據，并且可以對細胞群體的熒光強度分布進行詳細分析，從而深入了解轉染在細胞水平的異質性。

2. 細胞毒性檢測

• MTT 法測定細胞活性：在轉染后的不同時間點，向細胞培養(yǎng)孔中加入 MTT 溶液（終濃度為 0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 - 6 小時。然后小心吸去培養(yǎng)基，加入 DMSO 溶解結晶物，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定 570 nm 處的吸光度值。通過比較轉染組與未轉染對照組的吸光度值，計算細胞存活率，評估轉染方法對細胞活性的影響。細胞存活率 =（轉染組吸光度值 / 對照組吸光度值）× 100%。

• LDH 釋放檢測：收集細胞培養(yǎng)上清液，按照 LDH 檢測試劑盒的說明書操作，測定上清液中 LDH 的活性。LDH 是一種細胞內酶，當細胞受到損傷時，會釋放到細胞外。通過檢測上清液中 LDH 的活性，可以間接反映細胞的損傷程度，從而評估轉染方法的細胞毒性。

3. 基因表達與蛋白水平檢測

• 實時定量 PCR 檢測基因表達：提取轉染后細胞的總 RNA，使用逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉錄為 cDNA。然后以 cDNA 為模板，設計針對目的基因（如與視網膜細胞功能相關的特定基因）和內參基因（如 GAPDH）的特異性引物，進行實時定量 PCR 反應。通過比較轉染組與對照組目的基因的相對表達量（采用 2 - ΔΔCT 法計算），分析轉染對細胞基因表達的影響。

• Western blotting 檢測蛋白水平：收集轉染后的細胞，提取細胞總蛋白，采用 BCA 法測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進行 SDS - PAGE 電泳分離，然后轉移至 PVDF 膜上。用 5% 脫脂牛奶封閉膜后，分別加入針對目的蛋白和內參蛋白（如 β - actin）的一抗，4°C 孵育過夜。次日，用 TBST 洗滌膜后，加入相應的二抗，室溫孵育 1 - 2 小時。最后，使用 ECL 化學發(fā)光試劑進行顯色，通過成像系統(tǒng)采集圖像，并對目的蛋白條帶的灰度值進行分析，以評估轉染對細胞蛋白表達水平的影響。

三、結果

（一）轉染效率

1. 熒光顯微鏡觀察結果

• 在轉染后 24 小時，脂質體轉染組和電穿孔轉染組均可見部分細胞發(fā)出綠色熒光，但熒光強度和陽性細胞比例存在差異。脂質體轉染組的熒光細胞分布相對較散在，陽性細胞比例約為 20% - 30%；電穿孔轉染組的熒光細胞多呈聚集性分布，陽性細胞比例相對較高，約為 30% - 40%。

• 隨著時間的推移，到 48 小時時，兩組的熒光強度均有所增強，陽性細胞比例也有所增加。脂質體轉染組的陽性細胞比例達到約 30% - 40%，電穿孔轉染組則提高到約 40% - 50%。

• 至 72 小時，脂質體轉染組的陽性細胞比例穩(wěn)定在 40% 左右，而電穿孔轉染組的陽性細胞比例進一步上升至 50% - 60%。

2. 流式細胞術定量分析結果

• 與熒光顯微鏡觀察結果相符，流式細胞術檢測顯示，在 24 小時時，脂質體轉染組的轉染效率為 25.3% ± 3.2%，電穿孔轉染組為 35.6% ± 4.5%。

• 48 小時后，脂質體轉染組的轉染效率上升至 38.5% ± 4.1%，電穿孔轉染組達到 48.2% ± 5.3%。

• 72 小時時，脂質體轉染組的轉染效率為 42.1% ± 3.8%，電穿孔轉染組則高達 56.8% ± 6.1%。結果表明，電穿孔轉染在大鼠視網膜細胞中的轉染效率總體上高于脂質體轉染，且隨著時間的延長，這種差異逐漸明顯。

（二）細胞毒性

1. MTT 法測定細胞活性結果

• 在轉染后 24 小時，脂質體轉染組的細胞存活率為 85.2% ± 5.6%，電穿孔轉染組的細胞存活率為 78.3% ± 6.2%，兩組與未轉染對照組（細胞存活率設定為 100%）相比，均有一定程度的細胞活性下降，但差異不顯著。

• 到 48 小時時，脂質體轉染組的細胞存活率為 80.5% ± 4.8%，電穿孔轉染組的細胞存活率下降至 70.1% ± 5.9%，此時電穿孔轉染組與對照組的差異開始變得明顯（P < 0.05）。

• 72 小時后，脂質體轉染組的細胞存活率仍維持在 78.9% ± 5.2%，而電穿孔轉染組的細胞存活率進一步降低至 65.3% ± 6.5%，表明電穿孔轉染對大鼠視網膜細胞的細胞毒性隨著時間的延長逐漸顯現，且較脂質體轉染更為嚴重。

2. LDH 釋放檢測結果

• 轉染后 24 小時，脂質體轉染組上清液中 LDH 活性略有升高，為對照組的 1.2 倍 ± 0.15 倍；電穿孔轉染組上清液中 LDH 活性升高更為明顯，為對照組的 1.5 倍 ± 0.2 倍。

• 48 小時時，脂質體轉染組 LDH 活性為對照組的 1.3 倍 ± 0.2 倍，電穿孔轉染組則達到對照組的 1.8 倍 ± 0.3 倍。

• 72 小時后，脂質體轉染組 LDH 活性為對照組的 1.4 倍 ± 0.25 倍，電穿孔轉染組高達對照組的 2.1 倍 ± 0.4 倍。LDH 釋放檢測結果進一步證實了電穿孔轉染對細胞的損傷程度大于脂質體轉染。

（三）基因表達與蛋白水平

1. 實時定量 PCR 檢測基因表達結果

• 針對與視網膜細胞功能相關的目的基因，在轉染后 48 小時進行檢測。脂質體轉染組目的基因的相對表達量為對照組的 1.5 倍 ± 0.3 倍，電穿孔轉染組目的基因的相對表達量為對照組的 2.0 倍 ± 0.4 倍。結果表明，兩種轉染方法均能促進目的基因的表達，但電穿孔轉染的促進作用更為顯著。

2. Western blotting 檢測蛋白水平結果

• 與基因表達結果一致，Western blotting 檢測顯示，電穿孔轉染組目的蛋白的表達水平明顯高于脂質體轉染組。通過對蛋白條帶灰度值的分析，電穿孔轉染組目的蛋白的表達量約為脂質體轉染組的 1.6 倍 ± 0.3 倍，進一步說明電穿孔轉染在促進基因表達進而影響蛋白合成方面具有更高的效率。

四、討論