摘要：肝癌作為全球范圍內(nèi)高致死率的惡性腫瘤之一，亟待尋找新型高效的治療策略。本研究聚焦于天然生物堿 —— 苦參堿，旨在深度探究其對人肝癌 HepG2 細(xì)胞代謝基因水平的影響。通過一系列精心設(shè)計的細(xì)胞實驗，包括細(xì)胞培養(yǎng)、不同濃度苦參堿處理、CCK-8 檢測細(xì)胞活力、實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）以及蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）技術(shù)，系統(tǒng)剖析苦參堿干預(yù)下 HepG2 細(xì)胞代謝相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的動態(tài)變化。研究結(jié)果揭示，苦參堿可顯著改變 HepG2 細(xì)胞內(nèi)多條代謝通路關(guān)鍵基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖，有望為肝癌臨床治療提供新穎且堅實的理論依據(jù)與潛在治療靶點。
肝癌發(fā)病率逐年攀升，已然成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大難題。傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療手段雖取得一定成效，但副作用明顯，預(yù)后效果仍不理想，促使科研界不斷探尋新型抗癌藥物及治療機(jī)制。植物源天然產(chǎn)物因結(jié)構(gòu)多樣、生物活性豐富，在抗癌新藥研發(fā)領(lǐng)域備受矚目，苦參堿便是其中之一。
苦參堿提取自苦參等豆科植物，既往研究已初步證實其具備抗炎、抗病毒以及抗腫瘤等多重功效。然而，其針對肝癌細(xì)胞具體的作用靶點及內(nèi)在分子機(jī)制，尤其是在細(xì)胞代謝基因調(diào)控層面，尚未完整明晰。細(xì)胞代謝異?？胺Q腫瘤細(xì)胞的顯著特征，癌細(xì)胞憑借重塑代謝途徑來滿足快速增殖、侵襲所需的能量與物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒于此，深入挖掘苦參堿與肝癌細(xì)胞代謝基因間的交互作用，對于闡明其抗癌活性本質(zhì)、開發(fā)肝癌靶向治療策略意義非凡。
人肝癌細(xì)胞系 HepG2 購自細(xì)胞庫，于含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM 高糖培養(yǎng)基中，在 37℃、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞呈對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。
苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品純度＞98%，購自專業(yè)化學(xué)試劑公司；CCK-8 檢測試劑盒用于細(xì)胞活力測定；Trizol 試劑用于提取細(xì)胞總 RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 相關(guān)試劑用于基因表達(dá)定量；一抗、二抗及化學(xué)發(fā)光底物等用于 Western blot 檢測蛋白表達(dá)，均為業(yè)內(nèi)口碑良好、質(zhì)量可靠的品牌產(chǎn)品。
實驗設(shè)置空白對照組（僅含培養(yǎng)基）、溶劑對照組（含與最高苦參堿處理濃度等量的溶劑，確保溶劑無細(xì)胞毒性干擾）以及不同濃度苦參堿處理組，苦參堿終濃度梯度設(shè)定為 0.1 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM，每組設(shè)至少 3 個復(fù)孔，獨立重復(fù)實驗 3 次，確保數(shù)據(jù)可靠性與可重復(fù)性。依據(jù)前期預(yù)實驗及文獻(xiàn)調(diào)研選定濃度范圍，旨在全面捕捉苦參堿劑量效應(yīng)關(guān)系。
采用 CCK-8 法監(jiān)測苦參堿對 HepG2 細(xì)胞增殖活力的即時影響。將處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好且密度均勻的 HepG2 細(xì)胞，以每孔 5×103 個接種至 96 孔板，培養(yǎng) 24 h 待細(xì)胞貼壁后，更換含不同濃度苦參堿的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育 24 h、48 h、72 h。各時間點孵育結(jié)束前 4 h，向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，輕晃混勻，于酶標(biāo)儀 450 nm 波長處讀取吸光度值（OD 值）。依公式計算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）=（實驗組 OD 值 - 空白對照組 OD 值）/（溶劑對照組 OD 值 - 空白對照組 OD 值）× 100%，繪制細(xì)胞活力隨時間及苦參堿濃度變化曲線。
待苦參堿處理相應(yīng)時長后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷 PBS 漂洗細(xì)胞 2 次，按 Trizol 試劑說明書提取細(xì)胞總 RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及核酸定量儀檢測 RNA 純度、完整性與濃度，確保高質(zhì)量 RNA 用于后續(xù)實驗。以提取的 RNA 為模板，借助反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA 第一鏈，隨后進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)。選用 GAPDH 為內(nèi)參基因，針對代謝關(guān)鍵基因如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 1（GLUT1）、己糖激酶 2（HK2）、丙酮酸激酶 M2（PKM2）、乳酸脫氫酶 A（LDHA）等設(shè)計特異性引物，引物序列經(jīng) BLAST 比對驗證特異性，由專業(yè)生物公司合成。反應(yīng)體系依 qRT-PCR 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)配置，運行程序為：預(yù)變性 95℃ 30 s；變性 95℃ 5 s，退火延伸 60℃ 30 s，共 40 個循環(huán)；熔解曲線分析監(jiān)測產(chǎn)物特異性。通過 2?ΔΔCt 法計算各代謝基因相對表達(dá)量，精準(zhǔn)量化苦參堿引發(fā)的基因表達(dá)改變。
收集苦參堿處理后的 HepG2 細(xì)胞，加入適量 RIPA 裂解液（含蛋白酶、磷酸酶抑制劑）冰上裂解 30 min，高速離心收集上清獲取總蛋白，用 BCA 法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品經(jīng) SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h；分別孵育對應(yīng)一抗（抗 GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 及 β-actin 等，4℃過夜），TBST 緩沖液漂洗后孵育 HRP 標(biāo)記二抗（室溫 1 h）；再次漂洗，用化學(xué)發(fā)光底物顯影，于成像系統(tǒng)曝光采集條帶信號，ImageJ 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度比值表征蛋白相對表達(dá)水平，直觀展現(xiàn)苦參堿對代謝相關(guān)蛋白合成的調(diào)控作用。
CCK-8 檢測結(jié)果顯示，隨苦參堿濃度遞增及處理時間延長，HepG2 細(xì)胞活力顯著下降。與空白對照組及溶劑對照組相比，0.25 mM 及以上濃度苦參堿處理 24 h 后細(xì)胞活力開始明顯降低（P < 0.05）；處理 48 h、72 h 時，各濃度組細(xì)胞活力抑制效果更趨顯著，1 mM 苦參堿處理 72 h 組細(xì)胞活力降至不足對照組 30%，呈現(xiàn)清晰劑量、時間依賴趨勢，初步表明苦參堿對 HepG2 細(xì)胞增殖有強(qiáng)力抑制效能。
qRT-PCR 數(shù)據(jù)表明，苦參堿顯著干擾 HepG2 細(xì)胞多條代謝通路關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平。糖酵解途徑中，GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 基因表達(dá)隨苦參堿濃度增加呈不同程度下調(diào)，以 1 mM 苦參堿處理組最為突出，GLUT1 基因相對表達(dá)量降至對照組 0.3 倍左右（P < 0.01），HK2、PKM2、LDHA 也有 0.4 - 0.6 倍幅度降低，暗示苦參堿能阻礙癌細(xì)胞葡萄糖攝取及酵解進(jìn)程，限制能量快速生成。三羧酸循環(huán)相關(guān)基因如異檸檬酸脫氫酶（IDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）表達(dá)亦受影響，mRNA 水平有所降低，揭示苦參堿可擾亂癌細(xì)胞線粒體內(nèi)正常能量代謝循環(huán)，全方面破壞細(xì)胞供能體系。
Western blot 結(jié)果與基因表達(dá)趨勢基本契合，GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 蛋白條帶灰度值在苦參堿處理后顯著降低，表明蛋白合成量減少。尤為關(guān)鍵的是，PKM2 蛋白出現(xiàn)亞型轉(zhuǎn)換跡象，伴隨高活性四聚體向低活性二聚體轉(zhuǎn)變，這不僅影響糖酵解終末產(chǎn)物生成，還關(guān)聯(lián)細(xì)胞增殖、遷移信號通路調(diào)控，凸顯苦參堿多維度干預(yù)細(xì)胞代謝的復(fù)雜機(jī)制，從蛋白翻譯后修飾層面深度重塑癌細(xì)胞代謝格局。
本研究精準(zhǔn)揭示苦參堿對 HepG2 細(xì)胞代謝基因水平具有全方面、深層次調(diào)控作用，為理解其抗癌機(jī)制提供關(guān)鍵線索。細(xì)胞代謝重編程是癌細(xì)胞惡性表型維持根基，肝癌細(xì)胞偏好有氧糖酵解（“Warburg 效應(yīng)”），即便有氧條件下也大量攝取葡萄糖，經(jīng)低效酵解供能并累積代謝中間產(chǎn)物用于生物合成?？鄥A直擊這一核心異常代謝模式，下調(diào) GLUT1、HK2 等基因表達(dá)，從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運、糖酵解起始關(guān)鍵步驟削減葡萄糖流入與利用效率，打破癌細(xì)胞能量與物質(zhì)代謝平衡。
PKM2 作為糖酵解流量調(diào)控 “開關(guān)”，其亞型轉(zhuǎn)換受苦參堿誘導(dǎo)意義重大。四聚體 PKM2 利于糖酵解終產(chǎn)物丙酮酸生成，維持細(xì)胞增殖；二聚體 PKM2 則 “分流” 代謝物進(jìn)入合成代謝支路，且穿梭至細(xì)胞核激活癌基因轉(zhuǎn)錄?？鄥A促使 PKM2 二聚體增多，看似矛盾卻精妙抑制癌細(xì)胞增殖：一方面削弱糖酵解產(chǎn)能；另一方面擾亂核內(nèi)促癌信號，雙管齊下遏制肝癌進(jìn)展，拓展對 PKM2 功能多樣性及靶向干預(yù)策略的全新認(rèn)知。
三羧酸循環(huán)受損進(jìn)一步佐證苦參堿系統(tǒng)性打擊癌細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)。IDH、SDH 基因及蛋白受抑，線粒體呼吸鏈電子傳遞受阻，氧化磷酸化產(chǎn)能 “短路”，細(xì)胞內(nèi) ATP 匱乏，增殖、侵襲動力驟減。此代謝紊亂連鎖反應(yīng)還波及氨基酸、核苷酸代謝，全方面限制癌細(xì)胞生長必需原料合成，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、凋亡程序啟動，契合腫瘤代謝靶向治療理念。
本研究通過嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)胞實驗確證苦參堿可顯著改變 HepG2 細(xì)胞代謝基因表達(dá)譜、蛋白合成及活性，從糖酵解、三羧酸循環(huán)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)阻斷癌細(xì)胞代謝異常優(yōu)勢，抑制細(xì)胞增殖。這不僅夯實苦參堿抗癌藥理基礎(chǔ)，更勾勒出基于代謝基因靶點的肝癌治療新路徑。后續(xù)研究擬聚焦苦參堿與代謝基因啟動子區(qū)互作、信號通路上下游調(diào)控細(xì)節(jié)，結(jié)合體內(nèi)動物實驗及臨床樣本驗證，加速推動苦參堿從基礎(chǔ)研究邁向肝癌臨床精準(zhǔn)治療應(yīng)用，為肝癌患者燃起新希望，助力攻克這一頑固癌癥堡壘。
在未來探索征程中，苦參堿有望聯(lián)合傳統(tǒng)療法打造個性化抗癌方案，憑借天然低毒優(yōu)勢規(guī)避放化療嚴(yán)重副作用；還可啟發(fā)新型小分子代謝調(diào)節(jié)劑研發(fā)，靶向更多腫瘤特異性代謝節(jié)點，革新癌癥治療范式，腫瘤代謝研究領(lǐng)域邁向新階段，為全球癌癥防治事業(yè)注入磅礴動力。臨床轉(zhuǎn)化之路雖布滿荊棘，但本研究點亮的苦參堿抗癌之光，必將吸引學(xué)界同仁攜手奮進(jìn)，共同迎接肝癌治療曙光破曉。
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