前  言

免疫原性風(fēng)險評估是生物藥物開發(fā)的重要組成部分。多特異性抗體在治療方面表現(xiàn)出特異性好、選擇性好等特性，但由于其結(jié)構(gòu)組成、大小、是否含有Fc及靶點結(jié)合親和力等因素，容易產(chǎn)生免疫原性，且風(fēng)險評估挑戰(zhàn)大。

01多特異性抗體的免疫原性來源

序列注意事項

氨基酸序列和T細(xì)胞表位含量是產(chǎn)生免疫反應(yīng)風(fēng)險的主要因素。多特異性療法采用多種蛋白質(zhì)工程技術(shù)，以非天然方式將特定的結(jié)構(gòu)域匯集在一起，以便同時進(jìn)行多靶點識別，例如knobs-in-holes、CrossMAb、Triomab、SEED、CODV、DART®、TRIDENT、BiTE®、BiKE、TriKE、MATCH、nanobody、diabody、diabody-Ig等。

這類設(shè)計和優(yōu)化的單價或多價的抗體藥可能會增加抗體分子的免疫原性。例如，使用抗體片段和接頭分子可能導(dǎo)致產(chǎn)生全長親本抗體中不存在的新表位，或暴露隱藏在親本抗體結(jié)構(gòu)中的隱藏表位。與親本抗體相比，這些表位可能會增加雙特異性抗體的免疫原性風(fēng)險。

關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）

CQA風(fēng)險因素也與多特異性抗體相關(guān)，如蛋白質(zhì)聚集體、翻譯后修飾、宿主細(xì)胞和工藝相關(guān)雜質(zhì)（如HCP、HCD、內(nèi)毒素、色譜樹脂、污染物和降解物等）、制劑賦形劑和容器封閉等。鑒于多特異性抗體分子中不同功能域的非天然排列，與靶蛋白可能形成大型復(fù)合物，導(dǎo)致免疫原性風(fēng)險增加。如ABT-122和JNJ-61178104是在阿達(dá)木單抗（TNF-α，三聚體）骨架上添加IL-17A結(jié)合域（IL-17A，二聚體）的雙抗。在健康志愿者研究中，發(fā)現(xiàn)ABT-122和JNJ-61178104 的ADA發(fā)生率分別為99%和99.99%。

免疫調(diào)節(jié)  

多特異性療法關(guān)于免疫調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)在不斷增加，免疫原性風(fēng)險因素逐漸成為關(guān)鍵因素。如藥物分子是否涉及多個免疫檢查點的拮抗作用？是否結(jié)合B細(xì)胞？是否涉及免疫檢查點激動作用？nivolumab單一治療時ADA體發(fā)生率為11.2%，nivolumab與ipilimumab聯(lián)合治療時ADA躍升至37.8%。CD3是橋聯(lián)細(xì)胞的常用靶點，而CD3的結(jié)合似乎容易產(chǎn)生ADA反應(yīng)，如otelixizumab或teplizumab。此外，靶蛋白為多聚體膜蛋白的抗體分子，可介導(dǎo)細(xì)胞表面的復(fù)合物形成。當(dāng)這些靶點在抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)時，可以促進(jìn)復(fù)雜的攝取并增加T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

02多特異性抗體生物分析策略

多特異性抗體藥物較傳統(tǒng)單抗藥物更為復(fù)雜，整合PK、ADA和PD數(shù)據(jù)有助于了解免疫原性的臨床影響。運(yùn)用科學(xué)和戰(zhàn)略性的判斷非常重要，需要充分考慮測定形式、樣品收集的預(yù)分析以及靶標(biāo)和治療方法的潛在生物學(xué)。

藥代動力學(xué)PK

 一般多特異性抗體藥物PK方面的要求與單抗藥物相同，但需要對其固有特性予以特殊考慮。如用競爭的抗獨-特型抗體或靶點蛋白只能檢測同時具有未占據(jù)的抗TNF-α和未占據(jù)的抗IL-17A的完-全游離抗體分子。還需要額外檢測游離adalimumab或游離IL-17A結(jié)合域，可以用兩種靶點的競爭型抗獨-特型抗體與非競爭型抗獨-特型抗體配對，分別檢測兩種游離形式的分子。

抗藥抗體ADA

與PK生物分析策略考慮類似，多特異性抗體免疫原性測定的選擇和開發(fā)，也應(yīng)在藥物開發(fā)階段進(jìn)行適當(dāng)?shù)目茖W(xué)和戰(zhàn)略性思考。橋接法測定ADA可以檢測不同結(jié)合親和力水平和不同亞型的ADA，但這需要所檢測的樣本具有高Ctrough。另外，方法學(xué)開發(fā)要充分掌握靶點特點和藥物結(jié)構(gòu)。通?；诩?xì)胞的抗藥物中和抗體 (nAb)評估被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。如HC-12的整個臨床開發(fā)過程中評估nAb很重要，但我們建議不要開發(fā)專門的中和抗體檢測方法。相反，一種利用游離PK、PD和ADA等測定數(shù)據(jù)整合方法，比使用獨立的nAb測定更具信息價值。FDA指南指出，以數(shù)據(jù)整合方法判斷ADA中和活性具有潛力。

藥效PD

就HC-12而言，基于治療藥物的作用機(jī)制，適當(dāng)PD評估可能包括循環(huán)系統(tǒng)中游離TNF-α和IL-17A細(xì)胞因子以及自身免疫性疾病標(biāo)志物的定量檢測。雖然更具挑戰(zhàn)性和復(fù)雜性，但其PD評估可能包括TNF-α、IL-17A通路特異性細(xì)胞應(yīng)答。基于假設(shè)，這種PD生物標(biāo)志物應(yīng)該可以很好地跟蹤藥物濃度水平，并且以足夠靈敏檢測nAb反應(yīng)。

以上研究案例說明充分了解藥物和靶標(biāo)的潛在四級結(jié)構(gòu)對于多特異性抗體藥物研究尤為重要。這些結(jié)構(gòu)可能形成大型免疫復(fù)合物來增加免疫原性發(fā)生率。對于多特異性療法，在風(fēng)險評估中考慮藥理學(xué)對免疫原性的潛在影響至關(guān)重要。

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多種屬選擇：鼠、兔多種純化方式：Protein A、抗原親和、總?cè)薎gG、同型IgG

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