研究背景

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter）是一類ATP驅(qū)動(dòng)泵，在人類基因組已發(fā)現(xiàn)48種，分為7個(gè)亞家族（A-G）。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和兩個(gè)胞質(zhì)側(cè)ATP結(jié)合域（NBD）組成。TMD通過構(gòu)象變化實(shí)現(xiàn)分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，NBD結(jié)合或水解胞漿中的ATP，確保轉(zhuǎn)運(yùn)底物所需能量。而在ABCA亞家族中特-有的結(jié)構(gòu)是胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）和調(diào)控結(jié)構(gòu)域（RD），尚未在其他亞家族中發(fā)現(xiàn)。

南方科技大學(xué)龔欣課題組致力于研究ABCA亞家族相關(guān)蛋白的三維結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。2017年，龔欣老師作為顏寧教授課題組成員，在Cell雜志首-次報(bào)道了ABCA1近原子分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。近年來龔欣課題組陸續(xù)解析了ABCA3、ABCA4的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制模型。

ABCA3主要定位于肺泡II型（AT2）細(xì)胞內(nèi)的層狀體（LBs）。肺表面活性劑能夠降低肺泡表面張力，維持正常呼吸。ABCA3參與表面活性劑的生成，其突變會(huì)導(dǎo)致表面活性劑缺陷，引發(fā)嚴(yán)重的肺部疾病，如新生兒呼吸窘迫綜合征、間質(zhì)性肺炎等。目前還沒有治療ABCA3突變引起的遺傳性疾病藥物。

ABCA4基因只編碼視網(wǎng)膜上特定的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，ABCA4蛋白幾乎只存在于視網(wǎng)膜的視桿細(xì)胞的外節(jié)盤緣上。現(xiàn)有研究表明ABCA4作為翻轉(zhuǎn)酶，可以將磷脂酰乙醇胺（PE）和全反式視黃醛（ATR）形成的脂質(zhì)衍生物—視黃基磷脂酰乙醇胺（NRPE），從外節(jié)膜盤的腔內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)側(cè)，通過促進(jìn)NRPE的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)視網(wǎng)膜再生和生成維生素A。

ABCA4存在于視網(wǎng)膜細(xì)胞上，屬于脂質(zhì)內(nèi)向翻轉(zhuǎn)酶，可將NRPE從外節(jié)膜盤的腔內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)側(cè)。ABCA4的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能受損，會(huì)使得全反式視黃醛ATR和NRPE在外節(jié)膜盤的腔內(nèi)側(cè)發(fā)生過量積累，引起視網(wǎng)膜退行性疾病，如常見的遺傳性黃斑變性疾病、年齡相關(guān)的黃斑變性、色素性視網(wǎng)膜炎和錐桿營養(yǎng)不良等。盡管ABCA4在視覺系統(tǒng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、視循環(huán)過程中起著至關(guān)重要的作用，但此前對于ABCA4的分子結(jié)構(gòu)、底物識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還缺乏相應(yīng)的研究。

研究內(nèi)容

在本研究中，研究人員通過體外重組表達(dá)和純化獲得ABCA3蛋白、ABCA4蛋白，測定ABCA3、ABCA4各自的ATP酶活性和相應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，純化后的蛋白存在與先前報(bào)道一致的蛋白切割和糖基化修飾，均表現(xiàn)出強(qiáng)大的ATP酶活性。研究人員通過冷凍電鏡技術(shù)，確定ABCA3、ABCA4分別在apo狀態(tài)、結(jié)合ATP時(shí)的三維結(jié)構(gòu)。

01：ABCA3、ABCA4的結(jié)構(gòu)

 ABCA3與ABCA4結(jié)構(gòu)基本相似，兩者最-大區(qū)別是ECD結(jié)構(gòu)域的差異。研究發(fā)現(xiàn)，ABCA3的ECD只覆蓋堿基的核心區(qū)域，ABCA4的ECD結(jié)構(gòu)相對較大，可分為蓋層、隧道層和基底層三層，并且其中一個(gè)ECD中存在一個(gè)擴(kuò)展環(huán)用于底物結(jié)合。

圖1  ABCA亞家族蛋白三維結(jié)構(gòu)

02：ABCA4的底物識(shí)別

ABCA4對底物NRPE的識(shí)別進(jìn)一步說明TMD存在底物結(jié)合位點(diǎn)。ABCA4的底物NRPE被夾兩個(gè)TMD之間，但完-全暴露在脂質(zhì)雙分子層中，表明脂質(zhì)底物從管腔膜小葉側(cè)向進(jìn)入跨膜區(qū)的底物結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)存在PE時(shí)ATR可刺激ABCA4的ATP酶活性，在與NRPE底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，觀察到NRPE結(jié)合位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。

03：TMD在ABCA3、ABCA4中的構(gòu)象  

TMD區(qū)域內(nèi)存在“側(cè)向通道”，2個(gè)側(cè)向空腔可作為底物結(jié)合位點(diǎn)。本研究驗(yàn)證了基質(zhì)從膜內(nèi)小葉進(jìn)入的“側(cè)向通道”機(jī)制。在無核苷酸狀態(tài)下，ABCA3的TMDs表現(xiàn)出與ABCA4和ABCA1無核苷酸時(shí)相似的側(cè)向開放構(gòu)象，允許脂質(zhì)底物從2個(gè)膜小葉中側(cè)向進(jìn)入TMD。TMD內(nèi)2個(gè)帶正電荷的側(cè)向空腔可以作為潛在的底物結(jié)合位點(diǎn)，而填充在2個(gè)TMD之間空腔中的脂質(zhì)分子維持著TMD在這種側(cè)向開放構(gòu)象中的穩(wěn)定性，同時(shí)證明側(cè)向開放構(gòu)象是依賴ATP的結(jié)合。

04：ABCA轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制模型  

ABCA3、ABCA4的構(gòu)象在結(jié)合ATP前后發(fā)生相似的變化，通過“側(cè)向進(jìn)入和擠壓”機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)分子。當(dāng)無ATP和底物存在時(shí)，TMD表現(xiàn)出V型橫向開放構(gòu)象，允許NRPE從腔膜小葉橫向進(jìn)入，識(shí)別并結(jié)合底物。當(dāng)結(jié)合ATP后，NBD二聚化，TMD的V型側(cè)向開放構(gòu)象伴變成封閉構(gòu)象，無法與底物結(jié)合，將脂質(zhì)底物擠壓過膜，實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)底物的跨膜翻轉(zhuǎn)。

圖3   ABCA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制模型

研究結(jié)論

本研究通過冷凍電鏡解析ABCA3、ABCA4在不同轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)下的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，以及ATP驅(qū)動(dòng)脂質(zhì)底物轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的構(gòu)象變化，揭示ABCA3、ABCA4對脂質(zhì)底物獨(dú)-特的“側(cè)向進(jìn)入和擠壓”的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，為ABCA3、ABCA4的功能研究以及相關(guān)疾病的藥物研發(fā)提供重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也為闡明ABCA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供新方向。

義翹神州蛋白結(jié)構(gòu)研究產(chǎn)品

義翹神州成功開發(fā)系列無血清細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品，可用于HEK293、CHO、昆蟲細(xì)胞以及雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和蛋白表達(dá)。所有細(xì)胞培養(yǎng)基均為即用型，經(jīng)過數(shù)千種蛋白及抗體表達(dá)案例的驗(yàn)證，具有蛋白表達(dá)量高、細(xì)胞生長好、質(zhì)控嚴(yán)格、批次穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已經(jīng)被多個(gè)知-名實(shí)驗(yàn)室用于細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白表達(dá)研究。義翹神州已通過ISO 13485和ISO 9001雙認(rèn)證，培養(yǎng)基生產(chǎn)的整個(gè)過程嚴(yán)格按照GMP規(guī)范進(jìn)行管理，部分產(chǎn)品已完成美國FDA DMF備案，全面支持細(xì)胞治療、基因治療、抗體藥生產(chǎn)和診斷原料生產(chǎn)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

SMM 293-CD1無血清細(xì)胞培養(yǎng)基, Cat: M293CD1

廣泛適用各種HEK293細(xì)胞  

高效和高密度轉(zhuǎn)染  

即用型完-全培養(yǎng)基，不用添加其他組分  

無動(dòng)物源組分，無血清，化學(xué)成分明確