抗體偶聯(lián)藥物（ADC）是一種將小分子細(xì)胞毒素藥物通過連接子與單克隆抗體偶聯(lián)形成的藥物。與傳統(tǒng)的小分子化學(xué)治療以及抗腫瘤單抗相比，ADC藥物不僅可以提高化學(xué)治療的療效和腫瘤細(xì)胞的特異性，還可以降低或減弱系統(tǒng)毒性以及非靶向細(xì)胞毒性。ADC結(jié)構(gòu)復(fù)雜，異質(zhì)性高，存在多種產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)，其理化性質(zhì)分析與結(jié)構(gòu)表征不僅包括單抗部分，還包括小分子藥物相關(guān)的質(zhì)量屬性，可見ADC的質(zhì)量屬性研究較抗體更為復(fù)雜。本期#封面故事我們將圍繞藥物抗體比（Drug-to-antibody ratio, DAR）關(guān)鍵質(zhì)量屬性，闡述ADC藥物的質(zhì)量分析與控制的進(jìn)展與綜合分析方案。

ADC藥物經(jīng)過90多年的發(fā)展，特別是近來20多年的高速發(fā)展，目前經(jīng)過定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)是第三代ADC藥物成功開發(fā)的關(guān)鍵。小分子毒素與單克隆抗體的位點(diǎn)特異性結(jié)合確保ADC藥物具有明確、均一的DAR值（通常為2或4），這樣可以使藥物毒性降低，穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)顯著提高。第三代ADC藥物采用的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)技術(shù)主要包括Thiomab、ThioBridge、引入非天然氨基酸、引入序列標(biāo)簽或聚糖等。

藥物抗體比（Drug-to-antibody ratio, DAR）指抗體偶聯(lián)上毒素小分子數(shù)量的平均值，直接反映了靶向腫瘤細(xì)胞的載荷數(shù)量，同時(shí)影響藥物的安全性與有效性。如下圖 所示，DAR的分析方法主要分為二類：

A. 液相色譜法（HPLC-UV）

B. 質(zhì)譜法（LC-MS）

液相色譜法（HPLC-UV）

1) HIC-UV分析法：

疏水作用色譜（HIC-HPLC）是根據(jù)抗體偶聯(lián)不同數(shù)量的細(xì)胞毒性小分子之間疏水性不同，也即是具有不同DAR的ADC分子可在HIC中實(shí)現(xiàn)分離，未偶聯(lián)小分子藥物的抗體疏水性最弱，優(yōu)先被洗脫，偶聯(lián)小分子藥物數(shù)量越多的抗體，其疏水性就越強(qiáng)，典型譜圖見下圖 。

HIC-UV分析mAb與ADC譜圖

HIC是在非變性條件下進(jìn)行的，不僅可以用于不同DAR分子的分離，還可以用于純化，進(jìn)一步對(duì)分離純化后的HIC各組分進(jìn)行深度研究。

一般情況下，半胱氨酸的偶聯(lián)方式之一，是將抗體部分還原，打開鏈間二硫鍵，游離半胱氨酸上的巰基（-SH）與毒素小分子-連接子上的馬來酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)形成DAR=0-8分子異質(zhì)體ADC。依據(jù)計(jì)算公式DAR=∑（Weighted Peak Area）/100，最終得到加權(quán)平均DAR=3.6。

2) RPLC-UV方法：

反相高效液相色譜法（RP-HPLC）通常是在還原水平上分析DAR，即通過非變性還原條件下打開鏈間二硫鍵，然后根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的極性大小進(jìn)行分離，具有更好的分離度與分辨率。理論上基于半胱氨酸偶聯(lián)方式ADC經(jīng)過還原前處理后得到6種亞基分子類型，分別是L0、L1、H0、H1、H2與H3，見下圖所示：

基于半胱氨酸偶聯(lián)方式ADC的還原前處理

這里我們可以看到通過連接物與MMAF偶聯(lián)的曲妥珠單抗的DAR。該抗體通過部分還原使鏈間二硫鍵變?yōu)榘腚装彼釟埢?svg width="10px" height="10px" viewbox="0 0 16 16" class="ZDI ZDI--FourPointedStar16 css-1dvsrp" fill="currentColor">，之后該殘基再與小分子藥物通過連接物形成一種藥物抗體偶聯(lián)物。在此色譜圖中，我們可以觀察到重鏈和輕鏈，連接有小分子藥物或者沒有連接小分子藥物片段，分別用H0-H3和L0/L1來表示。DAR通過將H0-H3, L0和L1的峰面積相加來確定，并決定它們對(duì)mAb的貢獻(xiàn)，然后再取平均值。

曲妥珠單抗Mc-MMAF半胱氨酸偶聯(lián)物的平均DAR

色譜柱：bioZen Intact XB-C8，3.6μm

貨號(hào)：00F-4766-AN

規(guī)格：150x2.1mm

流動(dòng)相A：0.1%TFA水溶液

流動(dòng)相B：0.1%TFA in ACN

流速：0.4mL/min

檢測(cè)：LC-UV（280nm）

樣品：曲妥單抗mcMMAF半胱氨酸偶聯(lián)物（來源于ADC BiotechnologyLTD）

儀器：UPLC-UV

這里，我們采用了Phenomenex的bioZen Intact XB-C8色譜柱，此款色譜柱是core-shell結(jié)構(gòu)，類似于經(jīng)典的Kinetex系列：

對(duì)于ADC的Dar值分析，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

• 優(yōu)化的顆粒形態(tài)可實(shí)現(xiàn)更高效率的Intact RP

• 改善蛋白質(zhì)回收率

• 高溫穩(wěn)定性<90°C

以相同的分析方式，我們可以將標(biāo)準(zhǔn)子單元的分析平臺(tái)化，同時(shí)，也可以將具有不同linker的ADC平臺(tái)化。這樣可以加快分析速度。

色譜柱：bioZen3.6μmXB-C8

貨號(hào)：00F-4766-AN

規(guī)格：150x2.1mm

流動(dòng)相A：0.1%TFA in 水

流動(dòng)相B：0.1%TFA in 乙腈

流速：0.4mL/min

梯度：

28-34%B in 1-4minutes

34-65%B in 4-10minutes

檢測(cè)器：UV-Vis,280nm

溫度：80°

樣品：如圖所示

隨著越來越多的研究者采用特定位點(diǎn)的偶聯(lián)技術(shù)來提高治療效果和降低毒性，ADC的同質(zhì)化程度將會(huì)越來越高，DAR的分析也將變得更加簡(jiǎn)單。但是，隨著新型細(xì)胞毒素和連接物以及偶聯(lián)方法的增加，有效載荷復(fù)雜性不斷增加，這一趨勢(shì)將使DAR測(cè)定更多地轉(zhuǎn)向LC-MS技術(shù)，以利用其高分辨率分析能力。

質(zhì)譜法（LC-MS）

質(zhì)譜法可分為變性與非變性電噴霧質(zhì)譜法，兩種不同的方法均是根據(jù)物質(zhì)的分子量差異進(jìn)行DAR的分析?？贵w偶聯(lián)上不同數(shù)量細(xì)胞毒性小分子后，ADC呈現(xiàn)分子異質(zhì)性，不同的DAR物質(zhì)在高分辨質(zhì)譜的分析下具有不同的質(zhì)荷比（m/z），然后根據(jù)相對(duì)應(yīng)的DAR質(zhì)譜信號(hào)峰強(qiáng)度或峰面積計(jì)算平均DAR值。

1) 變性質(zhì)譜法（Denatured MS）

通常情況下，DAR在變性質(zhì)譜分析中，會(huì)使用到有機(jī)試劑流動(dòng)相與相對(duì)較高的柱溫，ADC在這兩種條件的共同作用下，非共價(jià)鍵連接的空間結(jié)構(gòu)被破壞，然后經(jīng)過電噴霧攜帶相對(duì)較多的電荷（H+），進(jìn)而產(chǎn)生信噪比（S/N）較好的質(zhì)譜峰圖。

變性質(zhì)譜常應(yīng)用于ADC賴氨酸偶聯(lián)方式的DAR分析，因其分子異質(zhì)性較高，往往在進(jìn)行質(zhì)譜分析之前，需要對(duì)其進(jìn)行去糖基化處理或者使用CPB酶去除C端賴氨酸的影響，以減少圖譜的復(fù)雜程度，便于后續(xù)的峰歸屬及最終的平均DAR計(jì)算。

Kadcyla ADC與生物類似藥ADC的去糖基化

2) 非變性質(zhì)譜法（Native MS）

非變性質(zhì)譜使用與質(zhì)譜兼容的流動(dòng)相體系，以及相對(duì)較低的柱溫與更溫和的電離方式，在不破壞物質(zhì)非共價(jià)鍵連接的立體空間結(jié)構(gòu)情況下，讓ADC生物大分子在氣相中保持自然折疊狀態(tài)，既可以用于ADC鏈間半胱氨酸偶聯(lián)方式的DAR分析，也可以用于賴氨酸偶聯(lián)方式的DAR分析。

HIC-MS非變性質(zhì)譜可與HIC-HPLC質(zhì)量放行方法相結(jié)合用于DAR的分析與質(zhì)控，具有高效率與高通量等特點(diǎn)。

SEC-MS非變性質(zhì)譜也常用于ADC DAR的分析與質(zhì)控。相對(duì)HIC-MS來說，流動(dòng)相可選擇揮發(fā)性的鹽溶液，與質(zhì)譜更兼容些。

我們分析了從Sigma購(gòu)得的市售半胱氨酸連接的ADC 模擬物，使用bioZen SEC-2與SCIEX® X500B聯(lián)用鑒定DAR 0到8。根據(jù)提取離子色譜圖，每種藥物抗體蛋白型都用于計(jì)算DAR。平均DAR計(jì)算為3.4，與Sigma報(bào)告值4.0±0.8匹配。我們看到在“天然”條件下，ADC保持完整，從而可以觀察到不同的DAR種類，并且可以標(biāo)記DAR和糖型。

LC Conditions

Column：bioZen 1.8μm SEC-2

Dimension：150x4.6mm

Part No.：00F-4769-E0

Recommended Guard：SecurityGuard™ ULTRA

Guard Cartridge Part No.：AJ0-9850

Guard Holder Part No.：AJ0-9000

Mobile Phase：100mM Ammonium Acetate

Flow Rate：200μL/min

Temperature：25℃

Detector：QTOF(SCIEX X500B)

Sample：Sigma ADC Mimic(MSQC8)，100μg

這里我們用到了bioZen 1.8µm dSEC色譜柱，這款色譜柱的特點(diǎn)一是采用了低孔隙體積的硅膠，實(shí)現(xiàn)更好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。二是采用了親水性二醇類鍵合表面，能夠防止硅膠表面與蛋白質(zhì)樣品相互作用。

比如我們還可以見到很多高分辨質(zhì)譜上的應(yīng)用：

Intact Mass：Cysteine-based conjugation (DAR)

同時(shí)，對(duì)于半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物，可以采用非變性的模式進(jìn)行分子量的檢測(cè)，從而分析DAR值。

半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物質(zhì)譜檢測(cè)圖譜

對(duì)于ADC藥物的開發(fā)而言，如何依據(jù)藥物的偶聯(lián)方式及目標(biāo)屬性去選擇合適的質(zhì)量控制方法、質(zhì)量控制項(xiàng)目與性質(zhì)合適的耗材，是助力藥物從理論設(shè)計(jì)走向?qū)嶒?yàn)室制備的重要環(huán)節(jié)。本文總結(jié)的幾種ADC藥物DAR值分析方法，不僅能給用戶提供不同的選擇，還能幫助用戶進(jìn)行不同方法的相互驗(yàn)證，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

后面我們會(huì)繼續(xù)跟蹤行業(yè)的進(jìn)展，給大家最及時(shí)的技術(shù)交流和分享。更多內(nèi)容，詳見《2023飛諾美色譜產(chǎn)品指南》

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