瓊脂糖凝膠電泳與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:它兼有"分子篩"和"電泳"的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力,大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大,因此在凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量,而且還取決于分子大小,這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質(zhì)太小,對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道,故瓊脂糖凝膠電泳是核酸分析常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單、快速,通過調(diào)整其使用濃度,使得分辨率達(dá)到大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求,因此成為分離、鑒定、純化核酸分子的常用方法。但操作過程中仍有不少要注意的問題。以下內(nèi)容對(duì)初涉分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)者有一定的指導(dǎo)意義。
1 凝膠制作
1.1 凝膠濃度
配制凝膠的濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而變,一般在0.8%~2.0%之間,
如果一次配制凝膠100 ml,沒用完的凝膠可以再次融化,但隨著融化次數(shù)的增加,水分丟失也越多,凝膠濃度則會(huì)越來越高,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定,補(bǔ)水辦法有兩個(gè):一是在容器上標(biāo)記煮膠前的刻度,煮膠后補(bǔ)充相應(yīng)的水分至原刻度;二是在煮膠前稱重,煮膠后補(bǔ)充水至原重量。粗略一點(diǎn)的方法是通過多次較恒定的煮膠條件得出一個(gè)經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)水值。以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。
1.2 梳板的選擇
一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板,梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定,一般來說,上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠,此時(shí)電泳條帶致密清晰,便于結(jié)果分析。另外,每次制膠時(shí)都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm,否則,拔梳板時(shí)易損壞凝膠孔底層,導(dǎo)致點(diǎn)樣后樣品滲漏。當(dāng)然,點(diǎn)樣孔的破壞還與拔梳板的時(shí)間和方法有關(guān),一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板,拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩沖液中,然后垂直向上慢慢用力,因?yàn)橛幸后w的潤(rùn)滑作用,梳板易拔出且不易損壞點(diǎn)樣孔。
2 點(diǎn)樣
在樣品中加入上樣緩沖液,上樣緩沖液中含有甘油或蔗糖以增加密度,使樣品沉入孔底;上樣緩沖液中一般還含有兩種指示劑,溴酚蘭和二甲苯青,用于指示樣品的遷移過程。上樣緩沖液儲(chǔ)存液一般為6×(10×),表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時(shí)上樣緩沖液應(yīng)稀釋到一倍濃度。點(diǎn)樣方法是將移液器基本垂直對(duì)準(zhǔn)點(diǎn)樣孔,用另一只手幫助固定移液器下端,移液器槍頭進(jìn)入點(diǎn)樣孔即可將樣品注入孔內(nèi),千萬不可將插至孔底。同時(shí)DNA分子上樣大小應(yīng)基本在分子量標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。
3 電泳
將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連,負(fù)極與負(fù)極相連。核酸帶負(fù)電荷,從負(fù)極向正極移動(dòng)。電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應(yīng)相同,電泳緩沖液剛好沒過凝膠1mm為好,電泳緩沖液太多則電流加大,凝膠發(fā)熱。電泳時(shí)所加電壓一般不超過5v/cm(指的是正負(fù)電極之間的距離,而不是凝膠的長(zhǎng)度),電泳時(shí)間一般為30~60 min,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可作適當(dāng)調(diào)整。電壓增高,電泳時(shí)間縮短,核酸條帶相對(duì)來說不夠整齊,不夠清晰;相反,電壓降低,電泳時(shí)間較長(zhǎng),核酸條帶整齊清晰。 另外,如果電泳后樣品泳動(dòng)很慢或者沒泳動(dòng),請(qǐng)檢查膠模兩端的封口膠條是否已去掉。
4 結(jié)果分析
較成功的電泳結(jié)果是分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶和樣品條帶整齊清晰,如果條帶模糊暗淡,單從瓊脂糖凝膠電泳角度來說,可能的原因:溴化乙錠的質(zhì)和量怎樣?溴化乙錠見光易分解,母液配制時(shí)間過長(zhǎng)或保存不當(dāng);電泳槽中緩沖液使用次數(shù)過多,緩沖能力下降。特別是TAE緩沖液,一般用2~3次就要更換,TBE緩沖液則可使用10次左右。溴化乙錠(EB)是一種中等強(qiáng)度誘變劑,操作過程中要戴手套,并將加有EB的染色液作好標(biāo)記、妥善保存。除了EB外,也可以使用Golden View,10000xSybr green I,AidGreen(GelGreen)核酸染料等進(jìn)行替代。
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