第一題 如何評估吸附能力強(qiáng)的化合物分子是吸附在細(xì)胞表面或是轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)部？清洗次數(shù)如何確定？

答：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞通過和MOCK細(xì)胞進(jìn)行對比，吸附能力強(qiáng)的化合物分子會在轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞和MOCK細(xì)胞上同時吸附，而轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞可將化合物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞，MOCK細(xì)胞不能進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，通過檢測結(jié)果即可判斷。清洗次數(shù)可以對每次清洗的上清液進(jìn)行檢測，當(dāng)清洗相應(yīng)次數(shù)后上清液檢測不到待測化合物時，即可確定清洗次數(shù)。

第二題 PROTAC，小核酸吸附強(qiáng)是否可以用膜囊泡？

答：對于PROTAC分子或小核酸這類吸附性強(qiáng)的化合物，使用膜囊泡模型是合適的，因?yàn)槟つ遗菘梢允笰BC轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物結(jié)合位點(diǎn)暴露于細(xì)胞外緩沖液中，更適用于研究候選藥物作為底物和抑制劑與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用。

第三題 瞬轉(zhuǎn)SLC細(xì)胞在液氮凍存，時間久了是否會影響蛋白活性？

答：SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體瞬時轉(zhuǎn)染會隨著時間延長，蛋白活性會逐步降低。

第四題 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞在藥物作用前去掉培養(yǎng)液后，是否需要用反應(yīng)緩沖液預(yù)孵育幾分鐘？

答：通常情況下，去掉培養(yǎng)液后，細(xì)胞可能會需要一段時間來適應(yīng)新的環(huán)境，使用反應(yīng)緩沖液預(yù)孵育可以幫助細(xì)胞穩(wěn)定，減少由于環(huán)境變化引起的影響。

第五題 實(shí)驗(yàn)過程中最后一步裂解囊泡除了乙腈是否可以使用其他的有機(jī)試劑？如果離心離不下來是否和裂解試劑不合適有關(guān)？

答：強(qiáng)堿類（NaOH），甲醇等均可以，離心推薦轉(zhuǎn)速8000rpm-16000rpm，離心力過低不易離心下去。

第六題 不同表達(dá)宿主，Sf9和HEK293，表達(dá)出來的Vesicle細(xì)胞是否會有差異？

答：Sf9和HEK293作為不同的宿主在蛋白質(zhì)修飾、折疊和分泌機(jī)制不同，相較于SF9而言，HEK293（人胚胎腎）細(xì)胞表達(dá)的Vesicle細(xì)胞其蛋白質(zhì)修飾和分泌機(jī)制更接近人體自然狀態(tài)下的生物過程。

第七題 早期化合物多篩選階段主要推薦做哪幾個轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)驗(yàn)？

答：主要推薦的轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)驗(yàn)包括底物抑制實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性實(shí)驗(yàn)，包括指南推薦的7種SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體。

第八題 做囊泡實(shí)驗(yàn)使用的反應(yīng)管是每個單獨(dú)的嗎？

答：是的，實(shí)驗(yàn)設(shè)計會使用單獨(dú)的反應(yīng)管來進(jìn)行囊泡實(shí)驗(yàn)，這樣可以為每個樣本提供更靈活的操作和處理?xiàng)l件。

第九題 選擇微孔板過濾器時，PVDF材質(zhì)和Glass Fiber這兩種材質(zhì)有何區(qū)別？

答：PVDF材質(zhì)和Glass Fiber各有特點(diǎn)，PVDF具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和耐熱性，而Glass Fiber則提供了較高的孔隙率和流速。針對囊泡裂解使用的是乙腈，PVDF材質(zhì)效果更好。

第十題 若低中濃度做出來不是轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物，高濃度做出來是，具體是什么原因？

答：首先需要確定低中濃度的范圍是否儀器可以檢測到，例如選取的底物濃度在儀器的檢測基線以下，則無法反應(yīng)準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

十一題 對于OATP1B1和1B3，采用共孵育也可以達(dá)到要求，是否還需要預(yù)孵育？

答：參照指導(dǎo)原則推薦，OATP1B1和1B3存在時間依賴性抑制，需要進(jìn)行預(yù)孵育。

十二題 囊泡的結(jié)果如何評判？

答：根據(jù)指導(dǎo)原則的要求，待測底物轉(zhuǎn)運(yùn)活性大于2倍，且通過已知抑制劑抑制率大于50%，即可判定為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物。待測抑制劑，需通過已知底物檢測，抑制率大于50%即可判定為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制劑。

十三題 反應(yīng)條件是水浴鍋還是搖床？

答：37℃水浴鍋或者搖床都可以，但搖床需要靜止。

十四題 囊泡、細(xì)胞、PAMPA三種實(shí)驗(yàn)是否有必要都做？若只做一種，優(yōu)先級是否為表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)體的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)？

答：囊泡、細(xì)胞和PAMPA三種實(shí)驗(yàn)各有優(yōu)勢和局限性。囊泡實(shí)驗(yàn)可以提供關(guān)于轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的直接信息，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以模擬體內(nèi)環(huán)境，而PAMPA則是一種快速篩選工具。如果只做一種實(shí)驗(yàn)，過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻模囊泡更接近人體自然狀態(tài)下的生物過程，同時便于檢測，因此優(yōu)先級較高。

十五題 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞藥物作用終止后，用乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑或反復(fù)凍融方法是否都可以裂解細(xì)胞？

答：是的，乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑以及反復(fù)凍融方法都可以用來裂解細(xì)胞。

十六題 高通透性化合物為什么不需要預(yù)孵育？透膜的能力是否和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合能力一致？

答：高通透性化合物不需要預(yù)孵育是因?yàn)樗鼈兛梢匝杆偻ㄟ^細(xì)胞膜，不需要額外的時間來與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合。透膜能力和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合能力并不總是一致的，因?yàn)樗鼈兪芏喾N因素的影響，包括分子大小、電荷、脂溶性等。

十七題 囊泡是否能搖？

答：底物與囊泡孵育過程需要靜置，都處于游離狀態(tài)時，底物與囊泡不易結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。

十八題 不能用水浴鍋是否因?yàn)榕涮椎墓茏硬皇欠忾]的？

答：配套的微孔過濾器適用于囊泡的后半部分進(jìn)行清洗過程，前期孵育需自備普通1.5ml離心管，或者PCR小管。

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