背景

靶向治療癌癥一直是科研界研究抗癌的一個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域。ERK與MYD88之間的相互作用已被證明對(duì)于RAS依賴的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞存活至關(guān)重要。因此，抑制ERK-MYD88相互作用可能成為一種有效的癌癥治療策略。然而，現(xiàn)有的ERK激酶抑制劑往往會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)和耐藥性，這就需要探索新的治療策略。

法國(guó)里昂癌癥研究中心Toufic Renno、Isabelle Coste團(tuán)隊(duì)在Nature Communications雜志發(fā)表了題為“Targeting ERK-MYD88 interaction leads to ERK dysregulation and immunogenic cancer cell death”的研究論文。在這項(xiàng)研究中，研究人員利用瑞孚迪（Revvity） HTRF PPI（蛋白-蛋白互作）試劑從66000個(gè)小分子中發(fā)現(xiàn)一種苯并咪唑類化合物EI-52能通過(guò)破壞ERK-MYD88相互作用誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異性免疫原性細(xì)胞凋亡，從而殺死腫瘤細(xì)胞并激活抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用。并且利用瑞孚迪Quantum GX2 microCT評(píng)價(jià)了其在活體動(dòng)物水平對(duì)于腫瘤細(xì)胞治療效果。

結(jié)果

1瑞孚迪HTRF PPI試劑助力ERK-MYD88相互作用抑制小分子EI-52的鑒定和表征

研究人員首先通過(guò)瑞孚迪均相時(shí)間分辨熒光 (HTRF) PPI（蛋白-蛋白互作）試劑分析篩選了約66,000個(gè)小分子，尋找能夠破壞MYD88蛋白D結(jié)構(gòu)域與ERK蛋白的D募集位點(diǎn)之間相互作用的分子,其篩選儀器采用瑞孚迪多功能酶標(biāo)儀EnVision。初步篩選出75種化合物，并根據(jù)理化性質(zhì)和構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行，最終選擇了苯并咪唑和螺環(huán)兩類具有相似活性的化合物進(jìn)行進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。苯并咪唑化合物EI-52（圖1A）通過(guò)熒光猝滅（圖1B）和HTRF實(shí)驗(yàn)（圖1C）顯示其與ERK1和ERK2結(jié)合，并抑制ERK與MYD88的相互作用。為確定EI-52在ERK上的結(jié)合位點(diǎn)，研究人員使用P2Rank預(yù)測(cè)引擎，識(shí)別出一個(gè)可能的結(jié)合槽 (Zone A) (圖1D) ，其包含多個(gè)重要的芳香族和帶負(fù)電的殘基。進(jìn)一步計(jì)算模型顯示，EI-52的二甲氨基苯基基團(tuán)可能與Zone A的天冬氨酸和谷氨酸殘基（ERK2中的D316、D319、E79）相互作用，SP-26作為對(duì)照化合物也顯示了類似的結(jié)合模式。研究人員在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ) (BiFC) 測(cè)定（圖1E）和鄰位連接測(cè)定 (PLA) (圖1F) 驗(yàn)證了EI-52抑制ERK-MYD88相互作用，并確認(rèn)ERK上的319位天冬氨酸對(duì)該結(jié)合至關(guān)重要（圖1G）。研究結(jié)果表明，EI-52可以直接與ERK蛋白的D募集位點(diǎn)結(jié)合并有效抑制ERK-MYD88的相互作用。

圖1：EI-52抑制ERK-MYD88蛋白-蛋白相互作用并誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡[1]

2小分子EI-52抑制劑可誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡

先前研究表明ERK-MYD88相互作用對(duì)癌癥的持續(xù)存在至關(guān)重要，因此研究人員探討了EI-52對(duì)癌細(xì)胞存活的影響。將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 (K-RasG13D) 暴露于8 μM的EI-52或相同濃度的ERK激酶抑制劑，48小時(shí)后，EI-52顯著誘導(dǎo)了癌細(xì)胞死亡（圖1H），而ERK激酶抑制劑處理后無(wú)明顯細(xì)胞死亡。螺環(huán)化合物SP-26同樣誘導(dǎo)了HCT116細(xì)胞死亡。流式細(xì)胞術(shù)顯示，HCT116細(xì)胞經(jīng)EI-52處理24小時(shí)后，磷脂酰絲氨酸暴露，表明細(xì)胞死亡為凋亡性（圖1I）。研究人員進(jìn)一步評(píng)估了幾十種EI-52類似物對(duì)ERK-MYD88相互作用的抑制能力及誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的效果。構(gòu)效關(guān)系 (SAR) 研究表明，一些類似物功能上與EI-52相似，而另一些則無(wú)效，這排除了EI-52生物活性是由苯并咪唑骨架非特異性效應(yīng)引起的可能性，并為后續(xù)藥物優(yōu)化提供了基礎(chǔ)。研究人員還擴(kuò)展了分析，測(cè)試了Oncopanel™集合中的301個(gè)細(xì)胞系對(duì)EI-52的反應(yīng)。結(jié)果顯示，80%的細(xì)胞系對(duì)EI-52表現(xiàn)出中等敏感性（IC50為3.4到11 µM），10%表現(xiàn)出高敏感性（IC50低于3.4 µM），另10%表現(xiàn)出低或無(wú)敏感性（IC50高于11 µM）（圖2A）。不同腫瘤類型對(duì)EI-52的反應(yīng)存在異質(zhì)性（圖2B）。與其他63種抗腫瘤參考化合物相比，EI-52的敏感性模式，表明其具有作用機(jī)制（圖2C）。

圖2：EI-52的活性在機(jī)理上是且與腫瘤類型無(wú)關(guān)[1]

3瑞孚迪Quantum FX microCT助力E1-52在活體小鼠抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

為了研究EI-52在體內(nèi)的抗腫瘤活性，研究人員在同系Lewis肺癌 (LLC) 模型中進(jìn)行了測(cè)試。體外實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，EI-52以IC50 = 4 μM的濃度誘導(dǎo)LLC細(xì)胞凋亡。腹腔內(nèi) (i.p.) 給藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，EI-52的生物利用度為52.9%，AUC為1129 ng/ml/h，適合用于概念驗(yàn)證研究。在LLC小鼠模型中，EI-52通過(guò)i.p.給藥表現(xiàn)出劑量依賴性抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果（圖3A）。在Kras-LA2自發(fā)性肺腫瘤模型中，通過(guò)瑞孚迪Quantum GX2 microCT掃描EI-52治療10周后顯著減少了肺部腫瘤負(fù)荷（圖3B），且未見(jiàn)肝臟、腎臟或脾臟的毒性跡象。此外，EI-52在雞胚胎絨毛尿囊膜 (CAM) 模型中未顯示出急性毒性，進(jìn)一步支持了其在體內(nèi)的安全性。研究人員還研究了EI-52在離體人類腫瘤中的抗癌效果?；颊邅?lái)源的結(jié)腸和肺腫瘤類器官在EI-52處理48小時(shí)后顯示出凋亡跡象（圖3C）。在頭頸癌切片的離體模型中，EI-52處理導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中強(qiáng)c-PARP染色，顯示其腫瘤特異性（圖3D）。綜上所述，EI-52通過(guò)抑制ERK-MYD88蛋白相互作用，能夠有效誘導(dǎo)人類癌細(xì)胞的凋亡，而無(wú)明顯毒性。

圖3：使用EI-52抑制ERK-MYD88蛋白相互作用觸發(fā)免疫原性癌細(xì)胞死亡和抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)[1]

4E1-52抑制ERK-MYD88蛋白相互作用誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡和抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)

為了解EI-52對(duì)整體轉(zhuǎn)錄活性的影響，研究人員使用Affymetrix芯片分析了HCT116細(xì)胞在EI-52處理16小時(shí)后的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NF-κB依賴的炎癥基因表達(dá)上調(diào)（圖4A），包括趨化因子（圖4B），這些基因的表達(dá)在RNA（圖4C）和蛋白質(zhì)水平上得到了證實(shí)（圖4D）。與MEK激酶抑制劑U0126不同，EI-52處理激活了NF-κB、CXCL1和CXCL8的轉(zhuǎn)錄（圖4E）。p65敲低實(shí)驗(yàn)顯示NF-κB在IL-8分泌中的關(guān)鍵作用（圖4F）。同時(shí)，EI-52處理后p65和ERK在HEK293T細(xì)胞中發(fā)生免疫共沉淀（圖4G），表明ERK蛋白復(fù)合體發(fā)生變化，可能帶來(lái)不同的生物學(xué)效應(yīng)。瀕死癌細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子被認(rèn)為是免疫原性細(xì)胞死亡 (ICD) 程序的一個(gè)指標(biāo)。EI-52誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡伴隨著ATP和HMGB1的釋放（圖4H），這些分子具有趨化活性，能夠吸引THP1巨噬細(xì)胞（圖4I）。而U0126未引起ICD介質(zhì)的產(chǎn)生或HCT116細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用（圖4H，I）。這些結(jié)果突顯了ERK激酶活性抑制與ERK-MYD88蛋白相互作用抑制之間的功能差異。在體內(nèi)研究中，腹腔注射EI-52 24小時(shí)后，腫瘤中檢測(cè)到240-440 ng/g的藥物濃度，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的PARP裂解（圖5A，B），表明系統(tǒng)性給藥EI-52可有效暴露腫瘤并迅速引發(fā)癌細(xì)胞的凋亡。研究人員還探討了T細(xì)胞對(duì)EI-52抗腫瘤活性的可能貢獻(xiàn)。結(jié)果顯示，EI-52處理僅在裸鼠中略微減緩腫瘤生長(zhǎng)，在T細(xì)胞功能正常的小鼠中，EI-52表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤效果，表明其能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)（圖5C）。此外，EI-52與抗PD1抗體聯(lián)合使用，顯著提高了抗腫瘤療效（圖5D）。

圖4：EI-52在體外誘導(dǎo)免疫原性癌細(xì)胞死亡[1]

圖5：EI-52抑制ERK-MYD88相互作用在體內(nèi)誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡和免疫T細(xì)胞反應(yīng)[1]

總結(jié)

在這篇報(bào)告中，研究人員介紹了兩類化合物（螺環(huán)和苯并咪唑類），它們通過(guò)作用于ERK蛋白的D募集位點(diǎn)區(qū)域，破壞ERK與MYD88的相互作用并擾亂ERK復(fù)合物，從而在體內(nèi)引發(fā)早期免疫原性凋亡和抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。雖然ERK-MYD88蛋白相互作用抑制劑EI-52對(duì)癌細(xì)胞的具體分子效應(yīng)仍需進(jìn)一步研究，但ERK伴侶蛋白的非典型調(diào)控、細(xì)胞死亡動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞系敏感性譜均指向一種作用機(jī)制。研究人員的研究表明，EI-52會(huì)導(dǎo)致活化的ERK錯(cuò)誤定位，并伴隨綜合應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡。

這些研究結(jié)果表明，通過(guò)抑制ERK-MYD88相互作用可能是一種有前景的癌癥治療方法。尋找靶向該相互作用的療法有望成為抗擊癌癥的關(guān)鍵。

在這項(xiàng)研究中，瑞孚迪公司的先進(jìn)技術(shù)和儀器發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

瑞孚迪整體藥物研究解決方案

采用HTRF PPI試劑搭配EnVision多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行高通量化合物篩選、靶點(diǎn)功能驗(yàn)證，從66000化合物中成功找到能阻斷ERK-MYD88結(jié)合小分子E1-52。

采用EnVision多功能酶標(biāo)儀超敏化學(xué)發(fā)光進(jìn)行了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

利用Quantum GX2 microCT進(jìn)行E1-52動(dòng)物活體水平肺部腫瘤治療評(píng)價(jià)。

關(guān)于HTRF技術(shù)

HTRF®(均相時(shí)間分辨熒光)源自諾貝爾學(xué)獎(jiǎng)成果，30年的技術(shù)沉淀，超萬(wàn)篇高分文獻(xiàn)引用，應(yīng)用廣泛！

HTRF®技術(shù)無(wú)需洗滌、操作簡(jiǎn)單、信號(hào)穩(wěn)定、靈敏度高、易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)等優(yōu)勢(shì)使其成為研究藥物靶標(biāo)的理想的平臺(tái)，被廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)的不同階段，從實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)、藥物篩選到后期驗(yàn)證。涉及的研究模型和靶點(diǎn)包括：GPCRs、激酶、表觀遺傳、蛋白互作、信號(hào)通路研究、細(xì)胞因子檢測(cè)等。

基于熒光供/受體標(biāo)記的一對(duì)抗體，由于生物分子相互作用導(dǎo)致熒光供體和受體靠近時(shí)，在光激發(fā)下，可產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET信號(hào)），且FRET信號(hào)與待測(cè)物濃度成正比。

關(guān)于Envision多功能酶標(biāo)儀

更快的速度、通量和靈敏度

EnVision多模式微孔板檢測(cè)儀具有更快的速度、更高通量和所有檢測(cè)技術(shù)中的上佳靈敏度。作為高通量篩選的金標(biāo)準(zhǔn)，EnVision微孔板檢測(cè)儀以更高靈敏度和通量，始終如一地為您提供強(qiáng)大的檢測(cè)性能和穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)。

集多項(xiàng)成熟技術(shù)于一身

標(biāo)準(zhǔn)EnVision系統(tǒng)可檢測(cè)所有傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)：

吸光度

熒光強(qiáng)度

熒光偏振

化學(xué)發(fā)光，包括輝光型化學(xué)發(fā)光、閃光性化學(xué)發(fā)光和雙報(bào)告基因化學(xué)發(fā)光

時(shí)間分辨熒光(TRF)和TR-FRET，包括我們的DELFIA、LANCE和LANCE Ultra技術(shù)，以及HTRF®和LanthaScreen™

提高性能容量和通量

我們的AlphaScreen®和AlphaLISA®激光檢測(cè)技術(shù)包括AlphaPlex™

超靈敏化學(xué)發(fā)光

TRF激光檢測(cè)模塊

四光柵模塊

關(guān)于Quantum GX2 microCT

Quantum GX2活體microCT系統(tǒng)能夠在不處死動(dòng)物的情況下對(duì)每一只動(dòng)物模型進(jìn)行多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的連續(xù)觀察而不用擔(dān)心輻射劑量問(wèn)題。Quantum GX2使用快速成像的CMOS平板檢測(cè)器，能夠縮短成像時(shí)間，同時(shí)利用回顧性的呼吸門控可以避免肺部呼吸造成的運(yùn)動(dòng)偽影，是在活體水平對(duì)肺相關(guān)疾病進(jìn)行評(píng)價(jià)的利器。