3.1 簡(jiǎn)介

食品和飼料由包含生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)所必需氨基酸的化合物組成。分析氨基酸含量對(duì)于確保合適的營(yíng)養(yǎng)非常重要。但是，這些產(chǎn)品是通過(guò)批量工藝生產(chǎn)的。與藥物生產(chǎn)一樣，批量工藝在生產(chǎn)運(yùn)行過(guò)程中，產(chǎn)出可能會(huì)有所不同。因此，必須考慮代表性樣品的構(gòu)成因素。通常需要采用二次抽樣策略。這些產(chǎn)品的氨基酸分析需要采用多種方法，以便正確分析樣品的總蛋白質(zhì)組成。由于食品和飼料是批量生產(chǎn)的，且其中包含非蛋白質(zhì)成分，因此建議使用液相水解方法。

注：含硫氨基酸 - 半胱氨酸和蛋氨酸，以及色氨酸在標(biāo)準(zhǔn)酸水解中不穩(wěn)定?？梢圆捎锰娲椒▉?lái)有效分析這些氨基酸。

本節(jié)介紹了三種不同的水解方法：

• 酸水解 - 測(cè)定總蛋白質(zhì)含量和組成

• 過(guò)甲酸氧化 - 測(cè)量含硫氨基酸 - 半胱氨酸和蛋氨酸

• 堿水解 - 評(píng)估色氨酸回收率

3.2 食品和飼料的酸水解

分析結(jié)合在蛋白質(zhì)中的氨基酸時(shí)，必須破壞肽鍵，釋放氨基酸以進(jìn)行分析（圖1）。對(duì)于要水解的飼料蛋白質(zhì)樣品，應(yīng)考慮樣品材料的pH值和存在的固體。如之前的小節(jié)所述，水解的速率或程度因蛋白質(zhì)中存在的氨基酸而異。對(duì)于食品材料中結(jié)合的蛋白質(zhì)而言尤其如此。和其他水解方法一樣，選擇參數(shù)的必須基于嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

在飼料分析中，必須牢記樣品制備的三個(gè)因素：

1. 樣品處理

2. 水解的樣品量

3. 用于水解的酸體積

3.2.1 樣品處理

飼料谷物及類(lèi)似的樣品通常不均勻。為了使這類(lèi)樣品盡可能地保持均勻，應(yīng)將樣品研磨成細(xì)粉。對(duì)于高脂樣品，可以在最終研磨前通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行脫脂處理。細(xì)粉可有效水解飼料蛋白質(zhì)。AOAC方法（4.1.11，994.12b，J.AOAC Int.88，2005，飼料的氨基酸分析）中要求將測(cè)試樣品研磨至能夠通過(guò)0.25 mm或60目篩（粒徑250 µm）的程度。

3.2.2 樣品量

對(duì)于飼料的氨基酸分析，AOAC方法建議使用以下計(jì)算來(lái)確定飼料分析中使用的樣品量。

要計(jì)算要使用的待測(cè)樣品的大致量，公式如下：

Ws = 1000/Ns

其中，Ns = 待測(cè)樣品的氮含量(%)，Ws = 與10 mg氮含量相當(dāng)?shù)拇郎y(cè)材料的重量(mg)。

一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于每個(gè)分析的樣品，所用材料的含量范圍約在100–1000 mg內(nèi)。

3.2.3 酸體積

如前所述，有效水解蛋白質(zhì)樣品需要大量過(guò)量的酸。飼料也不例外。但是，與第2.1.2節(jié)中討論的過(guò)量100倍不同，根據(jù)AOAC方法994.12中的說(shuō)明，添加的酸重量與樣品重量的比率范圍應(yīng)為50–500倍。由于該范圍較大，以及飼料中存在大量非蛋白質(zhì)顆粒物質(zhì)，因此要先對(duì)范圍進(jìn)行仔細(xì)地探索研究，然后才能將范圍應(yīng)用于常規(guī)飼料分析。

3.2.4 內(nèi)標(biāo)

使用內(nèi)標(biāo)(IS)可很好地補(bǔ)償樣品中各氨基酸可能發(fā)生的水解。沃特世建議在UPLC上使用正纈氨酸(Nva)作為AccQ•Tag Ultra的內(nèi)標(biāo)，在HPLC上使用α-氨基丁酸(AABA)或正亮氨酸作為AccQ•Tag的內(nèi)標(biāo)。AOAC方法994.12中推薦使用正亮氨酸作為飼料分析的內(nèi)標(biāo)。請(qǐng)謹(jǐn)慎選擇內(nèi)標(biāo)，確保色譜中氨基酸峰之間可以獲得所需的分離度。

3.2.5 AOAC 994.12 - 飼料中的氨基酸

文獻(xiàn)報(bào)道了多種適用于飼料中氨基酸分析的方法。此處介紹的方法改編自AOAC方法994.12“飼料中的氨基酸”。

3.2.5.1 設(shè)備和玻璃器皿：

• 分析天平（可讀性：±      0.1 mg）

• 上皿式天平

• 溶劑瓶，50      mL；聚乙烯

• 可使用水解試管、燒瓶

• 可使用消解器、加熱罩或水浴

• 過(guò)濾器裝置，0.22      µm（Millex GS、Millipore均適用）

• pH計(jì)，經(jīng)pH      2.0、4.0和7.0的緩沖液校正

• 回流冷凝器

• 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

• 玻璃燒杯（250      mL和1000 mL）

• 錐形瓶(150      mL)

• 圓底蒸發(fā)瓶(1000      mL)

• 量筒（100      mL、500 mL和1000 mL）

• 容量瓶(1000      mL)

• 移液管（10      mL和20 mL）

• 燒結(jié)玻璃過(guò)濾器（孔隙10–15      µm）

• 注射器

3.2.5.2 試劑

• DL-正亮氨酸（晶體）

• 濃鹽酸

• 氫氧化鈉，30%溶液(30 g/100 mL)

• 苯酚（晶體）

• 硫二甘醇（98%溶液）

• 二水合檸檬酸三鈉

• pH緩沖液（pH      2.0、4.0和7.0）

3.2.5.3 溶液制備

檸檬酸鈉緩沖液 - pH 2.20

1. 稱(chēng)取19.60      g二水合檸檬酸三鈉，放入1000 mL燒杯中。

2. 將其溶于約800      mL水中。

3. 攪拌時(shí)，加入10      mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。

4. 將溶液定量轉(zhuǎn)移至1000      mL容量瓶中，用水定容。

5. 使用燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾緩沖液。

6. 用HCl或2 M NaOH將pH調(diào)節(jié)至2.20。

6 M HCl-苯酚溶液

1. 稱(chēng)取1 g苯酚晶體，放入已去皮重的1000 mL燒杯中。

2. 將晶體溶于500      mL水中。攪拌時(shí)，緩慢加入500 mL HCl。

鹽酸溶液 - 1 M

1. 將約800      mL水倒入1000 mL容量瓶中。

2. 使用移液管加入83.3      mL HCl。

3. 用水定容并充分混合。

鹽酸溶液 - 0.1 M

1. 將約800      mL水倒入1000 mL容量瓶中。

2. 使用移液管加入100      mL 1 M HCl。

3. 用水定容并充分混合。

氫氧化鈉溶液(2 M NaOH)

1. 稱(chēng)取80.0      g NaOH，放入已去皮重的1000 mL燒杯中。

2. 在燒杯中，將顆粒緩慢溶于約600      mL水中。

3. 冷卻溶液并將其定量轉(zhuǎn)移至1000      mL容量瓶中。

4. 用水定容并充分混合。

內(nèi)標(biāo)溶液

1. 準(zhǔn)確稱(chēng)取195–200      mg DL-正亮氨酸晶體，放入已去皮重的150 mL錐形瓶中。

2. 用100 mL 1 M HCl溶解晶體。

3. 將溶液定量轉(zhuǎn)移至1000      mL容量瓶中，用水定容。

3.2.5.4 水解步驟

1. 準(zhǔn)確稱(chēng)取100–1000      mg研磨粉碎的待測(cè)樣品（精確至0.1 mg；相當(dāng)于氮含量約10 mg），放入帶標(biāo)記的水解試管中。使用之前小節(jié)中所述的計(jì)算方法確定要使用的實(shí)際樣品量。

2. 將50 mL 6 M HCl-苯酚溶液加入已稱(chēng)重的樣品中，稍稍攪拌。向溶液中加入2–3塊沸石。

3. 在通風(fēng)櫥中，使用平衡至110–120      °C溫度的加熱器或水浴，回流水解24 h。

4. 將水解試管從加熱裝置中取出，等待試管冷卻至室溫。

5. 使用移液管，將20      mL正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液加入各待測(cè)溶液中。搖動(dòng)燒瓶，將溶液混合。

6. 使用燒結(jié)玻璃過(guò)濾器將水解產(chǎn)物過(guò)濾到帶標(biāo)記的1000      mL的圓底蒸發(fā)瓶中。

7. 將蒸發(fā)瓶連接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在60      °C下蒸干。

8. 加入約20      mL水清洗，然后重復(fù)蒸發(fā)。重復(fù)清洗和蒸發(fā)步驟兩次。

9. 從蒸發(fā)儀中取出蒸發(fā)瓶。

10. 將50 mL檸檬酸鈉緩沖液加入蒸發(fā)后的水解產(chǎn)物中，充分混合，然后轉(zhuǎn)移至帶標(biāo)記的50      mL聚乙烯瓶中。

11. 現(xiàn)在可對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理。

3.3 使用過(guò)甲酸氧化法測(cè)定半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸

半胱氨酸和蛋氨酸是飼料材料分析中的關(guān)鍵氨基酸；兩者都可限制食用飼料動(dòng)物的生長(zhǎng)。由于標(biāo)準(zhǔn)酸水解條件不適用于這兩種特定氨基酸，因此通常替代使用過(guò)甲酸進(jìn)行氧化。該方法可將半胱氨酸和胱氨酸轉(zhuǎn)化為三聚氰酸，將蛋氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸砜（圖3）。然后可對(duì)樣品進(jìn)行有效的酸水解和衍生化處理。

文獻(xiàn)中報(bào)道了多種形式的過(guò)甲酸氧化。盡管總體過(guò)程相似，但具體情況有所不同。本指南中介紹了可用作可能起點(diǎn)的兩種流程。第一種方法來(lái)自AOAC 994.12。第二種方法基于MacDonald等人(1985)的報(bào)道，為其方法的替代方法。在選擇具體方法之前，必須仔細(xì)地評(píng)估和優(yōu)化。

3.3.1 過(guò)甲酸氧化，方法1，AOAC 994.12

3.3.1.1 設(shè)備和玻璃器皿

• 分析天平（可讀性：±      0.1 mg）

• 上皿式天平

• 溶劑瓶，50      mL；聚乙烯

• 可使用水解試管、燒瓶

• 可使用消解器、加熱罩或水浴

• 過(guò)濾器裝置，0.22      µm（Millex GS、Millipore均適用）

• pH計(jì)，經(jīng)pH      2.0、4.0和7.0的緩沖液校正

• 回流冷凝器

• 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

• 玻璃燒杯（250      mL和1000 mL）

• 錐形瓶(150      mL)

• 圓底蒸發(fā)瓶(1000      mL)

• 量筒（100      mL、500 mL和1000 mL）

• 容量瓶(1000      mL)

• 移液管（10      mL和20 mL）

• 燒結(jié)玻璃過(guò)濾器（孔隙10–15      µm）

• 冰浴

• 注射器

3.3.1.2 試劑

• 甲酸(88%)

• 過(guò)氧化氫(30%)

• 焦亞硫酸鈉

• DL-正亮氨酸（晶體）

• 濃鹽酸

• 氫氧化鈉，30%溶液(30 g/100 mL)

• 苯酚（晶體）

• 硫二甘醇（98%溶液）

• 二水合檸檬酸三鈉

• pH緩沖液（pH      2.0、4.0和7.0）

3.3.1.3 溶液制備

檸檬酸鈉緩沖液 - pH 2.20

1. 稱(chēng)取19.60      g二水合檸檬酸三鈉，放入1000 mL燒杯中。

2. 將其溶于約800      mL水中。

3. 攪拌時(shí)，加入10      mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。

4. 將溶液定量轉(zhuǎn)移至1000      mL容量瓶中，用水定容。

5. 使用燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾緩沖液。

6. 用HCl或2 M NaOH將pH調(diào)節(jié)至2.20。

6 M HCl-苯酚溶液

1. 稱(chēng)取1 g苯酚晶體，放入已去皮重的1000 mL燒杯中。

2. 將晶體溶于500      mL水中。攪拌時(shí)，緩慢加入500 mL HCl。

鹽酸溶液 - 1 M

1. 將約800      mL的水倒入1000 mL容量瓶中。

2. 使用移液管加入83.3      mL HCl。

3. 用水定容并充分混合。

鹽酸溶液 - 0.1 M

1. 將約800      mL的水倒入1000 mL容量瓶中。

2. 使用移液管加入100      mL 1 M HCl。

3. 用水定容并充分混合。

氫氧化鈉溶液(2 M NaOH)

1. 稱(chēng)取80.0      g NaOH，放入已去皮重的1000 mL燒杯中。

2. 在燒杯中，將顆粒緩慢溶于約600      mL水中。

3. 冷卻溶液并將其定量轉(zhuǎn)移至1000      mL容量瓶中。

4. 用水定容并充分混合。

內(nèi)標(biāo)溶液

1. 準(zhǔn)確稱(chēng)取195–200      mg DL-正亮氨酸晶體，放入已去皮重的150 mL錐形瓶中。

2. 用100 mL 1 M HCl溶解晶體。將溶液定量轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，用水定容。

過(guò)甲酸試劑

1. 在通風(fēng)櫥中制備。稱(chēng)取25      mg苯酚晶體，放入25 mL試管中。

2. 使用微量移液管加入0.5      mL 30% 過(guò)氧化氫。

3. 加入4.5      mL 88%甲酸溶液。

4. 用塞子塞緊試管，在室溫下等待混合物靜置30      min。

5. 30 min后，將試管置于冰浴中，等待過(guò)甲酸混合物冷卻15      min。

6. 請(qǐng)?jiān)谂R使用前制備試劑。

3.3.1.4 過(guò)甲酸氧化

1. 準(zhǔn)確稱(chēng)取100–1000      mg研磨粉碎的待測(cè)樣品（精確至0.1 mg；相當(dāng)于氮含量約10 mg），放入帶標(biāo)記的水解試管中。使用上述計(jì)算方法確定要使用的實(shí)際樣品量。

2. 將磁力攪拌器放入各試管中，并將水解試管置于冰浴(0      °C)中。

3. 等待過(guò)甲酸和待測(cè)樣品冷卻至少15      min后，向每個(gè)水解試管中加入5 mL過(guò)甲酸試劑；塞緊所有試管或蓋上蓋子，攪拌15 min。

4. 將水解試管放回冰浴中，等待樣品氧化16 h。

5. 取下玻璃塞，加入約0.84      g焦亞硫酸鈉以分解過(guò)甲酸。攪拌15 min，釋放SO₂。

6. 現(xiàn)在樣品可進(jìn)入酸水解階段。

3.3.1.5 水解步驟

1. 將50 mL 6 N HCl-苯酚溶液加入已稱(chēng)重的樣品中，稍稍攪拌。向溶液中加入2–3塊沸石。

2. 在通風(fēng)櫥中，使用平衡至110–120      °C溫度的加熱器或水浴，回流水解24 h。

3. 將水解試管從加熱裝置中取出，等待試管冷卻至室溫。

4. 使用移液管，將20      mL正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液加入各待測(cè)溶液中。搖動(dòng)燒瓶，將溶液混合。

5. 繼續(xù)下面的步驟(a-d)或(e-g)。

1. 使用燒結(jié)玻璃過(guò)濾器將水解產(chǎn)物過(guò)濾到帶標(biāo)記的1000       mL圓底蒸發(fā)瓶中。

2. 將蒸發(fā)瓶連接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，并在40       °C真空條件下蒸發(fā)至0.5 mL，注：請(qǐng)勿將溶液蒸干。

3. 從蒸發(fā)儀中取出蒸發(fā)瓶。

4. 將50       mL檸檬酸鈉緩沖液加入蒸發(fā)后的水解產(chǎn)物中，充分混合，然后轉(zhuǎn)移至帶標(biāo)記的50       mL聚乙烯瓶中。

5. 使用燒結(jié)玻璃過(guò)濾器將水解產(chǎn)物過(guò)濾到250       mL真空燒瓶中，然后將濾液轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中。

6. 將燒杯置于冰浴中。

7. 在攪拌的同時(shí)，使用約40       mL 7.5 M NaOH部分中和水解產(chǎn)物。（注：溫度不得超過(guò)40       °C。）使用2 M NaOH將pH調(diào)節(jié)至2.20。

     6.現(xiàn)在可對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理。

3.3.2 基于MacDonald等人(1985)報(bào)道的方法，進(jìn)行胱氨酸和蛋氨酸的過(guò)甲酸氧化和酸水解（方法2）

注：文獻(xiàn)中報(bào)道了許多有關(guān)該分析的不同參考資料，其中關(guān)于過(guò)甲酸和溴化氫的含量或蒸發(fā)溫度未達(dá)成一致。更改含量和/或溫度將影響步驟7中的蒸發(fā)時(shí)間。

3.3.2.1 材料

• 25 × 150 mm帶蓋試管

• 冰和冰浴

• 移液管

• 真空蒸發(fā)儀

• 潔凈的氮?dú)庠?/span>

• 恒溫箱或加熱器

• 玻璃量具

• 過(guò)甲酸

• 過(guò)氧化氫

• 甲酸

• 超純水

• HBr溶液，48%（重量比）

3.3.2.2 過(guò)甲酸試劑

1. 將1體積的30%過(guò)氧化氫加入9體積的88%甲酸中。

2. 將混合物靜置1 h，頻繁搖動(dòng)。

3. 將混合物置于冰浴中30      min，然后立即使用。

3.3.2.3 步驟

1. 稱(chēng)取相當(dāng)于約20      mg蛋白質(zhì)（精確至mg）的樣品，放入25 × 150 mm試管中。

2. 將樣品置于冰浴中30      min。

3. 向樣品中加入10      mL冷過(guò)甲酸，輕輕搖動(dòng)，然后使用Teflon墊片蓋密封。

4. 將樣品（仍處于大量冰中）置于冰箱中(0      °C)冷藏過(guò)夜(16 h)。

5. 16 h后，將樣品仍保存在0 °C條件下，加入3滴辛醇，然后加入3 mL冷卻的48% HBr，緩慢搖動(dòng)樣品。請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥中完成該步驟。將樣品在0 °C下靜置30 min。

6. 使用真空蒸發(fā)儀在37      °C下將樣品蒸干。該過(guò)程需要1–2 h。

7. 向試管中加入5 mL的6 N HCl。使用氮?dú)獯祾?/span>30 s，然后立即封蓋。

8. 將樣品置于110      °C恒溫箱中加熱24 h。

9. 將樣品從恒溫箱中取出，等待樣品冷卻。

10. 加入10      mL工作內(nèi)標(biāo)(5.0 µmol/mL)，并充分混勻。注：應(yīng)計(jì)算所用內(nèi)標(biāo)的實(shí)際濃度，以使進(jìn)樣至儀器的樣品量相同。

11. 將樣品定量轉(zhuǎn)移至250      mL容量瓶中，用HPLC級(jí)水沖洗樣品試管，并用沖洗液定容。

12. 使用0.45      µm樣品過(guò)濾器過(guò)濾步驟12中的樣品約1 mL。如果沒(méi)有立即進(jìn)行衍生化處理，請(qǐng)將加蓋的樣品儲(chǔ)存于冰箱中。注：離心可代替該過(guò)濾步驟。離心以產(chǎn)生澄清的上清液。

3.4 通過(guò)堿水解分析飼料中的色氨酸

在標(biāo)準(zhǔn)酸水解條件下，色氨酸(Trp)不穩(wěn)定，無(wú)法進(jìn)行有效分析。因此，將堿水解用作飼料中該氨基酸釋放和分析的替代方法。此方法使用4.2 M NaOH水解蛋白質(zhì)。它的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，完成后無(wú)需進(jìn)行衍生化步驟。只需進(jìn)行UV檢測(cè)(280 nm)的儀器分析即可。

此處介紹的步驟改編自AOAC方法988.15“食品以及食品和飼料成分中的色氨酸“。

3.4.1 設(shè)備和材料

• 改良微量凱氏燒瓶（Kjeldahl      flask，可從Ace Glass, Inc.訂購(gòu)）- 25 mL微量凱氏燒瓶，內(nèi)徑12 mm，頸長(zhǎng)15 cm。頸部收縮至內(nèi)徑約6 mm，在燒瓶球部上方5 cm。

• 真空泵

• 膜式過(guò)濾器和0.45      µm過(guò)濾器

• 干冰

• 水浴

• 水浴用乙醇

• 移液管和玻璃器皿

• pH計(jì)

3.4.2 試劑

• 經(jīng)Milli-Q系統(tǒng)(Millipore Corp.)純化的水，或同等級(jí)水

• 4.2 M NaOH

• 1-辛醇

• pH 4.25檸檬酸鈉緩沖溶液

• HCl

• 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液

• 儲(chǔ)備液 -       1 mg/mL。將250 mg L-色氨酸溶于100 mL水中（其中添加有六滴HCl）中。用水稀釋至250 mL。

• 工作溶液I -       0.1 mg/mL。用水將10 mL儲(chǔ)備液稀釋至100 mL。

• 工作溶液II       - 0.04 mg/mL。用水將4       mL儲(chǔ)備液稀釋至100 mL。

• 不使用時(shí)，請(qǐng)冷藏標(biāo)準(zhǔn)品溶液。請(qǐng)每月制備新鮮溶液。

3.4.3 制備待測(cè)樣品

1. 在配備1 mm篩網(wǎng)的離心式磨機(jī)中研磨實(shí)驗(yàn)室樣品；充分混合。

2. 稱(chēng)取包含100      mg蛋白質(zhì)的待測(cè)樣品，放入改良微量凱氏燒瓶中。

3. 對(duì)于脂質(zhì)含量      > 5%的待測(cè)樣品：

1. 在燒瓶中，將10       mL石油醚加到已稱(chēng)重的待測(cè)樣品中。

2. 輕輕搖動(dòng)混合，并超聲處理20       min。靜置。必要時(shí)離心。

3. 盡可能多地吸出石油醚，小心地避免吸出任何固體。

4. 在溫和的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)剩余的石油醚。繼續(xù)進(jìn)行水解。

4. 對(duì)于脂質(zhì)含量      < 5%的待測(cè)樣品：繼續(xù)進(jìn)行水解。

3.4.4 堿水解步驟

1. 通過(guò)氮?dú)夤呐?/span>10      min，從4.2 M NaOH中除去氣泡。

2. 將10 mL排除氣泡的4.2 M NaOH加入各燒瓶中。

3. 加入三滴1-辛醇。

4. 立即在干冰/乙醇浴中冷凍處理后的溶液。然后從干冰/乙醇浴中取出燒瓶并且抽真空至10 mm。

5. 關(guān)閉真空并密封燒瓶。

6. 將密封的燒瓶置于室溫下裝有水的燒杯中，直至待測(cè)溶液融化。

7. 將燒瓶置于110      °C恒溫箱中加熱20 h。

8. 等待燒瓶冷卻至室溫。

9. 用1 mL pH 4.25的檸檬酸鈉緩沖溶液沖洗燒瓶頸部，將沖洗液收集到燒杯中。

10. 將水解產(chǎn)物定量轉(zhuǎn)移至同一50      mL燒杯中，用兩份pH 4.25的檸檬酸鈉緩沖液沖洗燒瓶。

11. 用3.5 mL HCl中和溶液并用力攪拌。將pH調(diào)節(jié)至4.25 ± 0.05。

12. 將溶液定量轉(zhuǎn)移至25      mL容量瓶中，用水定容。

13. 將溶液倒入40      mL離心管中，并在1150 G下離心20 min。

14. 使用玻璃纖維濾紙(Whatman      GF/A)過(guò)濾上清液。

15. 將濾液轉(zhuǎn)移到離心管中，并在23,000      G下離心10 min。

注：此時(shí)可以取上清液等分試樣進(jìn)行UV (289 nm)分析，無(wú)需衍生化處理。