01 ATAC-seq 原理介紹

染色體結(jié)構(gòu)

人類基因組DNA直線長度接近2m，而細(xì)胞的平均直徑一般在幾十微米，要保證DNA的復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控能夠準(zhǔn)確、高效的進(jìn)行，需要將細(xì)胞核中的DNA經(jīng)過多個(gè)水平高度有序的包裝。

2個(gè)H3-H4二聚體和2個(gè)H2A-H2B二聚體形成約11nm的組蛋白八聚體，DNA纏繞其上形成核小體，每個(gè)核小體上大約含有146bp的DNA，核小體相互串聯(lián)成為30nm水平纖絲染色質(zhì)。細(xì)胞周期的不同時(shí)期，染色質(zhì)濃縮程度不同，在分裂間期，染色質(zhì)相對松散，具有轉(zhuǎn)錄活性的同時(shí)DNA暴露區(qū)域也可被特定的核酸酶接近并切割，而在分裂期，染色質(zhì)進(jìn)一步包裝為結(jié)構(gòu)緊密的染色體狀態(tài)，此時(shí)呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄惰性。

染色質(zhì)可接近性概念

染色質(zhì)分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，在結(jié)構(gòu)上常染色質(zhì)折疊壓縮程度低，處于伸展?fàn)顟B(tài)。DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，DNA的致密高級(jí)結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮顟B(tài)，這部分打開的染色質(zhì)，稱之為開放染色質(zhì)（open chromatin）。染色質(zhì)一旦被打開，就允許一些調(diào)控蛋白，比如轉(zhuǎn)錄因子和輔因子與之相結(jié)合，染色質(zhì)的這一特性，就叫做染色質(zhì)可接近性（chromatin accessibility）。這一特性反映了染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活躍程度。特定條件下的染色質(zhì)開放性變化可以提供大量的基因表達(dá)調(diào)控信息。

 Nature Reviews Genetics, 2014, 15(4):272.

  圖2：染色質(zhì)的可接近性轉(zhuǎn)換

轉(zhuǎn)錄因子及基因表達(dá)調(diào)控

真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程是大量的順式作用元件與反式作用因子相互作用的結(jié)果，具有調(diào)控功能的反式作用因子通過結(jié)合染色質(zhì)開放區(qū)域調(diào)控真核細(xì)胞基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別并結(jié)合起始位點(diǎn)上游序列，如GC Box、CAAT Box和TATA Box等順式作用元件，從而啟動(dòng)基因的開放表達(dá)。遠(yuǎn)端調(diào)控的增強(qiáng)子，沉默子、絕緣子同樣也可以通過結(jié)合順式作用元件參與調(diào)控基因表達(dá)的開放和關(guān)閉。轉(zhuǎn)錄因子與基因組結(jié)合時(shí)，取代了核小體的位置，暴露出DNA，使其對酶的切割更為敏感。在此基礎(chǔ)上，利用染色質(zhì)對DNase的敏感性，鑒定活化的調(diào)控序列?；虮磉_(dá)調(diào)控是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，在轉(zhuǎn)錄和翻譯中，染色體三維結(jié)構(gòu)也會(huì)處于動(dòng)態(tài)變化中。 

全基因組染色質(zhì)可接近性研究       

目前染色質(zhì)可接近性的研究方法主要通過酶解或者化學(xué)方法來分離可接近區(qū)域或者受保護(hù)區(qū)域的DNA序列，然后再經(jīng)過高通量測序分析。轉(zhuǎn)座酶引入高通量測序之前，基因組范圍內(nèi)染色質(zhì)可接近性的研究方法主要包括 MNase-seq，DNase-seq和FAIRE-seq，這些方法可以幫助我們在大量的細(xì)胞系和組織樣本中鑒定出轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄活性開始的位置、核小體和核小體修飾、增強(qiáng)子和絕緣子等。

MNase-seq：微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease，MNase）是一種限制性外切酶，進(jìn)行片段化處理時(shí)，將DNA切成缺口后，逐個(gè)切除寡核苷酸，直到獲得被核小體包裹或者被轉(zhuǎn)錄因子綁定的區(qū)域?yàn)橹?。目前MNase消化法和二代測序聯(lián)合使用，通過定性和定量的方式來識(shí)別基因組范圍內(nèi)的平均核小體占據(jù)率、定位以及染色質(zhì)開放區(qū)域。

                                    圖4：MNase-Seq原理圖

DNase-seq：基因活躍表達(dá)時(shí)啟動(dòng)區(qū)域部分序列可能解旋成單鏈，從而不能繼續(xù)纏繞在核小體上，使啟動(dòng)區(qū)DNA裸露在組蛋白表面，形成對DNaseI的超敏現(xiàn)象。容易被DNase｜切割的位點(diǎn)稱為超敏感位點(diǎn)。這些位點(diǎn)是調(diào)控元件如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、絕緣子和轉(zhuǎn)錄因子等的結(jié)合位點(diǎn)。DNase-seq技術(shù)與MNase-seq技術(shù)互補(bǔ)，利用DNase｜優(yōu)先切割超敏感位點(diǎn)然后對生成的片段進(jìn)行測序。該方法可用于檢測特定轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合位點(diǎn)。

FAIRE-seq： FAIRE （Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements）甲醛輔助分離調(diào)控元件，是借助有機(jī)溶劑甲醛對染色體中裸露的DNA 進(jìn)行固定，通過細(xì)胞裂解與超聲打斷再進(jìn)行CHCL3抽提獲取水相中的DNA，在CHCL3抽提的過程中，蛋白未交聯(lián)的DNA溶于水相中，而蛋白結(jié)合型的DNA留在兩相界面，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)間3-4天。將FAIRE-seq與ChIP-seq、DNase-seq聯(lián)用可以用于揭示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、核小體位置分布、染色質(zhì)開放區(qū)域以及三者之間的關(guān)系。

這些研究染色質(zhì)開放區(qū)域、核小體定位、轉(zhuǎn)錄因子占位或者染色質(zhì)生物學(xué)“狀態(tài)”的注釋方法都涉及多個(gè)試驗(yàn)流程，操作復(fù)雜，需要大量細(xì)胞作為研究樣本，并且樣本準(zhǔn)備過程非常繁瑣。

為了解決這些問題，2013年Standford 大學(xué) William Greenleaf 實(shí)驗(yàn)室的Buenrostro等發(fā)布了一項(xiàng)整合的、多維的遺傳學(xué)分析方法-ATAC-seq，這種方法通過Tn5轉(zhuǎn)座酶將測序的adapters插入到基因組上的“可接近”區(qū)域來標(biāo)記調(diào)控區(qū)域。

ATAC-seq

ATAC-seq 全稱 Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，是利用轉(zhuǎn)座酶研究染色質(zhì)可接近性的高通量測序技術(shù)。其原理是利用轉(zhuǎn)座酶Tn5可切割開放染色質(zhì)區(qū)域的特性，對Tn5酶捕獲到的DNA序列進(jìn)行測序。DNA轉(zhuǎn)座，是把DNA序列從染色體的一個(gè)區(qū)域搬運(yùn)到另外一個(gè)區(qū)域的現(xiàn)象，由DNA轉(zhuǎn)座酶來實(shí)現(xiàn)。只要人為地將攜帶已知DNA序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座復(fù)合物（即下圖中帶紅／藍(lán)色序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座酶Tn5復(fù)合物）與細(xì)胞核一起孵育，再利用帶P5、P7以及index的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可形成文庫，經(jīng)過測序就可以得到開放染色質(zhì)的區(qū)域信息。

ATAC-seq 可低至20個(gè)細(xì)胞便能快速的獲取調(diào)控的多維信息，更加適用于珍貴稀少的樣本，且ATAC-seq無片段選擇性，所以這種方法可以同時(shí)獲得“開放”染色質(zhì)的位置、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、核小體的調(diào)控區(qū)域和染色質(zhì)狀態(tài)等信息。

相對于其他三種染色質(zhì)開放區(qū)域研究，ATAC-seq經(jīng)過一次實(shí)驗(yàn)，能夠獲得染色體在某個(gè)特定時(shí)空條件下所有開放染色質(zhì)區(qū)域，并不僅僅局限于某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，或者某個(gè)特定的組蛋白乙?；瘏^(qū)域。

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