角膜的主要結(jié)構(gòu)為角膜基質(zhì)層，占整個(gè)角膜厚的90％左右，在維持角膜高透明度和人眼正常視覺功能方面發(fā)揮著重要作用。人類角膜基質(zhì)細(xì)胞是角膜基質(zhì)中的主要細(xì)胞類型。它們?cè)诩?xì)胞外基質(zhì)的分泌和組裝以維持角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的高度排列以及角膜基質(zhì)創(chuàng)面修復(fù)中都發(fā)揮著不可替代的關(guān)鍵作用。人類角膜基質(zhì)細(xì)胞在受到機(jī)械創(chuàng)傷、病原體感染或藥物中毒的刺激后，會(huì)死亡或發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致角膜水腫，嚴(yán)重的情況下，角膜會(huì)變得渾濁甚至失明。因此，探究人類角膜基質(zhì) 細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性顯得尤為重要。

細(xì)胞的生物功能高度依賴于它與基底的相互作用。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)所用的基底不同， 細(xì)胞的形態(tài)和力學(xué)特性也會(huì)有所差異， 探索細(xì)胞-底物相互作用和細(xì)胞對(duì)力刺激的反應(yīng)正日益成為細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)重要課題，例如細(xì)胞粘附、變形、定向遷移、凋亡等。原子力顯微鏡（AFM）能夠在納米尺度上提取軟生物樣品的結(jié)構(gòu)信息。此外， AFM可以通過(guò)測(cè)量角膜基質(zhì)細(xì)胞表面的模量和捕捉形態(tài)學(xué)來(lái)確定離散的角膜層的局部機(jī)械性能。利用AFM的進(jìn)展,如峰值力定量納米機(jī)械原子力顯微鏡,可以快速獲取樣品的力學(xué)性能。

天津理工大學(xué)天津市機(jī)電系統(tǒng)設(shè)計(jì)與智能控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王鑫老師團(tuán)隊(duì)^[1]通過(guò)探究角膜基質(zhì)細(xì)胞-底物之間的相互作用對(duì)細(xì)胞形態(tài)及力學(xué)特性的影響。將角膜基質(zhì)細(xì)胞分別培養(yǎng)在三種不同硬度的基底上，三種基底分別為空白普通培養(yǎng)皿（硬基底）， 2D膠原上（鼠尾Ⅰ型膠 原蛋白包被的培養(yǎng)皿）， 3D膠原上（三維鼠尾Ⅰ型膠原蛋白的培養(yǎng)皿）， 通過(guò)布魯克生物型原子力顯微鏡（Bioscope）表征角膜基質(zhì)細(xì)胞的形貌，并且利用AFM力曲線陣列模式獲得角膜基質(zhì)細(xì)胞上選定區(qū)域的力-位移曲線， 通過(guò)模型擬合力-位移曲線獲得相應(yīng)的彈性模量， 以此探究角膜基質(zhì)細(xì)胞在不同基底上的力學(xué)特性。將角膜基質(zhì)細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)液中且保證液體溫度在37℃左右。待溫度穩(wěn)定后，再進(jìn)行樣本掃描，使用的AFM工作模式為Peak Force QNM in Fluid，得到角膜基質(zhì)細(xì)胞的形貌圖，再利用AFM的force volume模式對(duì)已測(cè)得的細(xì)胞形貌區(qū)域內(nèi)做力-位移曲線。將細(xì)胞壓痕保持在彈性范圍內(nèi)。角膜基質(zhì)細(xì)胞上所測(cè)得的典型力-位移曲線如圖1。

圖1.角膜基質(zhì)細(xì)胞的單個(gè)力－位移曲線

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)測(cè)得的力-位移曲線，藍(lán)色曲線表示探針壓入細(xì)胞的過(guò)程，稱其為加載曲線，紅色曲線表示探針離開細(xì)胞表面的過(guò)程，稱其為卸載曲線。已知的量有探針對(duì)細(xì)胞施加的載荷Ｆ，針尖壓入細(xì)胞表面的深度δ，針尖半徑Ｒ，細(xì)胞的泊松比ν，通過(guò)曲線擬合就可以得到細(xì)胞表面的彈性模量值。

利用AFM采集到的三種不同基底上的角膜基質(zhì) 細(xì)胞形貌如圖2所示。將采集到的細(xì)胞形貌圖像利用AFM離線分析后再經(jīng)過(guò)軟件進(jìn)行后處理分析，對(duì)圖像進(jìn)行壓平處理，得到最后的角膜基質(zhì)細(xì)胞的AFM形貌圖。

圖2.角膜基質(zhì)細(xì)胞的AFM形貌圖

從圖2看出角膜基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)總體呈梭形形狀，而長(zhǎng)在硬基底 圖2a上的角膜基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈梭形較長(zhǎng)，且鋪展面積較小，在３Ｄ膠原圖2b上生長(zhǎng)的角膜細(xì)胞生長(zhǎng)形狀和鋪展面積均適中，而在２Ｄ膠原 圖2c 上的角膜細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)轭愃迫堑男螤钋忆佌姑娣e也變大。

AFM 具有納米級(jí)的成像分辨率，可以在近生理?xiàng)l件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高分辨形貌成像和力學(xué)性能測(cè)量，利用AFM技術(shù)獲得不同硬度的培養(yǎng)基底上角膜基質(zhì)細(xì)胞的形貌圖和角膜基質(zhì)細(xì)胞的彈性信息，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在不同硬度的基底上的形貌有所差別，培養(yǎng)在越軟的基底上，角膜基質(zhì)細(xì)胞的形狀由在硬基底上的梭形逐漸變化為類似三角形狀，且鋪展面積變大。

原子力顯微鏡近年來(lái)成為研究細(xì)胞形貌和力學(xué)特性的一種新興的工具，在生物材料方面具有準(zhǔn)確的活細(xì)胞定量力學(xué)性質(zhì)成像、高分辨率的生物分子和細(xì)胞成像、動(dòng)態(tài)生物過(guò)程的快速掃描等優(yōu)勢(shì)，將獲取生物樣品中的物理結(jié)構(gòu)、生化相互作用過(guò)程和力學(xué)性能信息變成可能。

◆ 使用電容傳感器技術(shù)的探針掃描方式

◆ PeakForce Tapping和QI模式，適用于針對(duì)精細(xì)樣品的高分辨率成像與高級(jí)力控制