Protection of neutrophils by bone marrow mesenchymal stromal cells is enhanced by tumor-associated inflammatory cytokines

Keywords: G-CSF; inflammation; mesenchymal stromal/stem cells; neutrophil; tumor progression.

間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSCs），也稱為間充質(zhì)干細(xì)胞，是許多組織中的細(xì)胞成分，有助于組織修復(fù)和體內(nèi)平衡。除了產(chǎn)生成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞外，MSCs 還表現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫抑制作用。研究表明，MSCs 可以通過對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細(xì)胞（如 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞）的免疫抑制作用來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展。MSCs 遷移到腫瘤部位后，也被證明可以通過募集單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

中性粒細(xì)胞是骨髓中的主要細(xì)胞成分，由干細(xì)胞增殖和分化為成熟的中性粒細(xì)胞。研究表明，中性粒細(xì)胞參與腫瘤進(jìn)展。然而，目前尚不清楚 MSCs 是否以及如何在腫瘤進(jìn)展過程中影響中性粒細(xì)胞。

基于此，溫州醫(yī)科大學(xué)大分子藥物與規(guī)模化制備全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦科研究團(tuán)隊(duì)檢測(cè)了荷瘤小鼠骨髓中的 MSCs 和中性粒細(xì)胞，并在體外測(cè)試了 MSCs 對(duì)中性粒細(xì)胞的影響。研究發(fā)現(xiàn) MSCs 保護(hù)中性粒細(xì)胞免于凋亡，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞成熟，可能是通過產(chǎn)生 G-CSF 來實(shí)現(xiàn)的，且荷瘤小鼠血清中升高的炎性細(xì)胞因子 IFNγ 和 TNFα 可以顯著刺激 MSCs 產(chǎn)生更多的 G-CSF。這些發(fā)現(xiàn)表明，MSCs 可以影響中性粒細(xì)胞，并可能為腫瘤免疫治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。研究成果發(fā)表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Protection of neutrophils by bone marrow mesenchymal stromal cells is enhanced by tumor-associated inflammatory cytokines”。

首先，為了確定骨髓中的 MSCs 是否可能影響中性粒細(xì)胞，評(píng)估了野生型（WT）和荷瘤小鼠（10 周齡 MMTV-pyMT）中的 MSCs 和中性粒細(xì)胞。與對(duì)照組相比，荷瘤小鼠中 MSCs 的百分比和絕對(duì)數(shù)量增加，表明骨髓中的 MSCs 對(duì)腫瘤進(jìn)展有反應(yīng)。來自骨髓的 MSCs 進(jìn)一步表征為 CD73- CD45- CD11b- Sca1+ CD44+ CD29+。有趣的是，與對(duì)照組相比，荷瘤小鼠的中性粒細(xì)胞也相應(yīng)地富集。這些數(shù)據(jù)表明，MSCs 和中性粒細(xì)胞在荷瘤小鼠的骨髓中均升高。

值得注意的是，與野生型小鼠相比，荷瘤小鼠的中性粒細(xì)胞核分葉（nuclear segmentation）顯著增加（圖1 A），表明 WT 和 PyMT 小鼠之間中性粒細(xì)胞特征存在潛在差異。為了說明 PyMT 和 WT 小鼠乳腺中中性粒細(xì)胞之間的差異，進(jìn)一步分析了 GSE164766 的 RNA-seq 基因表達(dá)，結(jié)果顯示，2877 個(gè)基因（832 個(gè)顯著下調(diào)和 2045 個(gè)顯著上調(diào)）在兩組之間差異表達(dá)（圖1 B）。KEGG 分析顯示，基因集的變化與 MAPK 信號(hào)通路、NF-kappa B 信號(hào)通路和 PI3K-Akt 信號(hào)通路密切相關(guān)（圖 1 C）。然后，對(duì) 2877 個(gè) DEGs 進(jìn)行了 GSEA 分析，顯示上述三種通路的基因特征在 PyMT 組中顯著富集（圖1 D、E）。通路圖顯示，與細(xì)胞周期、存活和炎癥相關(guān)的基因調(diào)控因子上調(diào)，提示荷瘤小鼠來源的中性粒細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的增殖、抗凋亡和促瘤能力。

圖1    鑒定源自 WT 和 PyMT 小鼠的中性粒細(xì)胞之間的 DEG。

接下來，為了探討 MSCs 對(duì)中性粒細(xì)胞的可能影響，分別從骨髓中分離出中性粒細(xì)胞和 MSCs，共培養(yǎng) 24 小時(shí)。有趣的是，當(dāng)與 MSCs 共培養(yǎng)時(shí)，反映細(xì)胞凋亡的 Annexin V + 中性粒細(xì)胞顯著減少（圖2 A）。一致地，共培養(yǎng)物中剩余的中性粒細(xì)胞更多（圖2 B）。此外，在共培養(yǎng)中，中性粒細(xì)胞更成熟，反映在細(xì)胞核分葉的增加（圖2 C）。這些數(shù)據(jù)表明，MSCs 可能充當(dāng)骨髓中中性粒細(xì)胞的保護(hù)者，使其免于凋亡并促進(jìn)成熟。

圖2     MSCs 減少中性粒細(xì)胞凋亡并促進(jìn)中性粒細(xì)胞成熟。

進(jìn)一步地，實(shí)驗(yàn)確定了 MSCs 對(duì)中性粒細(xì)胞的保護(hù)作用是否是由 MSCs 產(chǎn)生的可溶性因子介導(dǎo)的。為此，在有或沒有 MSC培養(yǎng)基（MSC-CM）的情況下培養(yǎng)中性粒細(xì)胞。與對(duì)照組相比，MSC-CM 減少了中性粒細(xì)胞凋亡并防止了中性粒細(xì)胞的丟失（圖3 A、B），表明來源于 MSCs 的某些細(xì)胞因子可能介導(dǎo)了保護(hù)作用。

粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）均能促進(jìn)中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，直接對(duì)中性粒細(xì)胞起作用而增強(qiáng)該細(xì)胞的功能。因此，檢測(cè)了 MSCs 條件培養(yǎng)基中 G-CSF 和 GM-CSF 的水平，發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)不到兩者水平的對(duì)照組相比，MSCs 上清液中只有 G-CSF 升高（圖3 C）。此外，荷瘤小鼠血清中的 G-CSF 水平較高，但在 WT 組中檢測(cè)不到（圖3 D）。有趣的是，作為關(guān)鍵炎性細(xì)胞因子的 IFNγ 和 TNFα 水平在荷瘤小鼠中也顯著增加（圖3 D）。

為了測(cè)試腫瘤相關(guān)的 IFNγ 和 TNFα 是否可以刺激 G-CSF 的產(chǎn)生，使用這兩種細(xì)胞因子處理 MSCs，發(fā)現(xiàn)用 IFNγ 和 TNFα 聯(lián)合處理的 MSCs 在 mRNA 水平和蛋白質(zhì)水平上比未處理或用單一細(xì)胞因子處理的 MSCs 產(chǎn)生更多的 G-CSF（圖3 E），表明 MSCs 可能通過產(chǎn)生 G-CSF 對(duì)中性粒細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，并且 MSCs 中的 G-CSF 表達(dá)在腫瘤微環(huán)境特征的炎癥條件下進(jìn)一步上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，G-CSF 在 MSCs-中性粒細(xì)胞軸中起關(guān)鍵作用。

圖3    TNFα 和 IFNγ 誘導(dǎo) MSCs 產(chǎn)生更多的 G-CSF。

最后，研究驗(yàn)證了 IFNγ 和 TNFα 處理的 MSCs 是否可以更有效地保護(hù)中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)用 IFNγ 和 TNFα 處理的 MSCs 確實(shí)顯示出減少的中性粒細(xì)胞凋亡，且維持中性粒細(xì)胞數(shù)量的能力增強(qiáng)（圖4 A、B）。利用抗體阻斷 G-CSF 可以減弱對(duì)中性粒細(xì)胞的保護(hù)作用（圖4 C）。此外，在暴露于 IFNγ 和 TNFα 處理的 MSCs 的中性粒細(xì)胞中觀察到更多的分葉過多的細(xì)胞核，但當(dāng)使用抗體消除 G-CSF 信號(hào)時(shí)，則沒有這種影響（圖4 D）。這些數(shù)據(jù)表明，IFNγ 和 TNFα 誘導(dǎo)的 MSCs 可以通過 G-CSF 信號(hào)進(jìn)一步保護(hù)中性粒細(xì)胞并促進(jìn)其成熟。

圖4    IFNγ 和 TNFα 處理的 MSCs 顯示出更強(qiáng)的減少中性粒細(xì)胞凋亡和促進(jìn)中性粒細(xì)胞成熟的能力。

總之，該研究結(jié)果表明，骨髓 MSCs 可以在體外保護(hù)中性粒細(xì)胞免于凋亡，并促進(jìn)其分化為多分葉中性粒細(xì)胞，在炎癥條件下，MSCs 可以產(chǎn)生更多的 G-CSF 來富集中性粒細(xì)胞，發(fā)揮越來越強(qiáng)的保護(hù)作用，表明 MSCs 可能在骨髓中性粒細(xì)胞的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？傊@些結(jié)果為骨髓中 MSCs 在炎癥和腫瘤發(fā)生過程中的潛在功能提供了見解。

參考文獻(xiàn)：Liang Y, Lou X, Xu Y, Zheng Z. Protection of neutrophils by bone marrow mesenchymal stromal cells is enhanced by tumor-associated inflammatory cytokines. Front Immunol. 2024 Apr 16;15:1361596. doi: 10.3389/fimmu.2024.1361596. PMID: 38690266; PMCID: PMC11058655.

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