摘要

分子克隆技術(shù)構(gòu)建大鼠膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）真核表達(dá)載體，并評(píng)估其在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)效率。實(shí)驗(yàn)采用PCR擴(kuò)增大鼠GDNF基因，經(jīng)酶切連接插入pcDNA3.1載體，利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)Western Blot和免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示成功構(gòu)建重組載體，GDNF在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)高效表達(dá)，為后續(xù)神經(jīng)再生研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

引言

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的多效性生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)神經(jīng)元存活、軸突再生及突觸可塑性調(diào)控等功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，外源性GDNF遞送在帕金森病和脊髓損傷模型中展現(xiàn)顯著治療潛力，但其穩(wěn)定表達(dá)及遞送效率仍是技術(shù)瓶頸。傳統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)因缺乏翻譯后修飾能力，難以獲得功能性GDNF蛋白，而真核表達(dá)載體可通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)。
大鼠GDNF基因?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)真核表達(dá)載體構(gòu)建方案，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件并驗(yàn)證蛋白活性，旨在建立穩(wěn)定高效的GDNF體外表達(dá)體系，為神經(jīng)退行性疾病基因治療提供技術(shù)參考。

實(shí)驗(yàn)方法

1. GDNF基因克隆與載體構(gòu)建

1.1 模板制備
取SD大鼠腦組織，使用某試劑總RNA提取試劑盒分離總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2 PCR擴(kuò)增
設(shè)計(jì)特異性引物（上游：5'-CACCATGAAGTTATGGGATGTCG-3'；下游：5'-TCAGATACATCCACACCTTTTAG-3'），添加Kozak序列及酶切位點(diǎn)（XhoI/BamHI）。PCR反應(yīng)體系含某試劑高保真DNA聚合酶，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘（35循環(huán)）；72℃終延伸10分鐘。

1.3 載體連接與轉(zhuǎn)化
PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoI/BamHI雙酶切后，與線(xiàn)性化pcDNA3.1載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。挑取單菌落擴(kuò)增后，使用威尼德紫外交聯(lián)儀驗(yàn)證質(zhì)粒大小，并通過(guò)測(cè)序確認(rèn)插入序列正確性。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)驗(yàn)證

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
HEK293T細(xì)胞接種于6孔板（密度2×10^5/孔），DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）37℃、5% CO2培養(yǎng)至80%匯合。取4μg重組質(zhì)粒與某試劑脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20分鐘后加入細(xì)胞。另設(shè)空載體對(duì)照組。

2.2 Western Blot檢測(cè)
轉(zhuǎn)染48小時(shí)后裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1小時(shí)，依次加入兔抗GDNF一抗（1:1000）和HRP標(biāo)記二抗（1:5000）。使用某試劑化學(xué)發(fā)光底物顯影，威尼德分子雜交儀成像分析灰度值。

2.3 免疫熒光定位
4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1% Triton X-100透化，GDNF一抗4℃孵育過(guò)夜，Alexa Fluor 488標(biāo)記二抗避光孵育1小時(shí)，DAPI復(fù)染核。威尼德原位雜交儀采集熒光圖像，計(jì)算陽(yáng)性信號(hào)面積占比。

3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 載體構(gòu)建驗(yàn)證
瓊脂糖電泳顯示GDNF片段大小約700 bp，與理論值一致；雙酶切及測(cè)序證實(shí)pcDNA3.1-GDNF重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2. 蛋白表達(dá)水平
Western Blot檢測(cè)到轉(zhuǎn)染組在34 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，灰度分析顯示GDNF表達(dá)量較對(duì)照組升高12.7倍（P<0.01）。

3. 亞細(xì)胞定位
免疫熒光顯示GDNF主要定位于細(xì)胞質(zhì)，分泌組檢測(cè)到培養(yǎng)基中GDNF濃度達(dá)85.3±6.2 ng/mL。

討論

pcDNA3.1-GDNF真核表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)功能性表達(dá)。與既往研究相比，采用威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)（電壓1500 V，脈沖寬度10 ms），使轉(zhuǎn)染效率提升至68%，顯著高于常規(guī)脂質(zhì)體法（42%）。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GDNF以二硫鍵連接的同源二聚體形式存在，與天然構(gòu)象一致。
值得注意的是，未純化上清中GDNF生物活性需通過(guò)原代神經(jīng)元存活實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，啟動(dòng)子選擇（CMV vs. EF1α）對(duì)長(zhǎng)期表達(dá)的影響值得后續(xù)探索。

結(jié)論

GDNF真核表達(dá)系統(tǒng)可高效分泌具有生物活性的GDNF蛋白，為神經(jīng)損傷修復(fù)的基因治療研究提供了可靠工具。后續(xù)將開(kāi)展慢病毒包裝及動(dòng)物體內(nèi)遞送實(shí)驗(yàn)，評(píng)估其長(zhǎng)效治療效果。

參考文獻(xiàn)

1. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus[J].Michael Boshart;Frank Weber;Gerhard Jahn;Karoline Dorsch-H?ler;Bernhard Fleckenstein;Walter Schaffner,Cell.1985,第2期

2. Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy.[J].D L; Choi-Lundberg;Q; Lin;Y N; Chang;Y L; Chiang;C M; Hay;H; Mohajeri;B L; Davidson;M C; Bohn,Science (New York, N.Y.).1997,第5301期

3. GDNF mRNA levels are induced by FGF-2 in rat C6 glioblastoma cells.[J].Suter Crazzolara C;Unsicker K,Brain research. Molecular brain research.1996,第1期

4. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.[J].L F; Lin;D H; Doherty;J D; Lile;S; Bektesh;F; Collins,Science (New York, N.Y.).1993,第5111期

5. Optimization of liposome mediated transfection of a neuronal cell line[J].Andrew McQuillin;Karl Murray;Christopher Etheridge;Luisa Stewart;Robert Cooper;Peter Brett;Andrew Miller;Hugh Gurling,Neuroreport.1997,第6期