IPS誘導(dǎo)腸類器官培養(yǎng)分為三大階段：人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)、內(nèi)胚層分化及中/后腸模式化誘導(dǎo)、類器官培養(yǎng)。

人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

1、人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基配制

（1）2-8℃解凍hPSC Medium Supplement，融化后上下晃動(dòng)混勻，按實(shí)際用量進(jìn)行分裝，立即使用或儲(chǔ)存于-20~-80℃，避免反復(fù)凍融；

（2）按1:50的比例將hPSC Medium Supplement(10mL)加入到hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基(abs9403)。

注意：混勻后的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基可在2-8℃穩(wěn)定儲(chǔ)存2-3周，不建議使用配制已超過(guò)3周的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。

（3） 實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。

注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要37℃水浴加熱。

二、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無(wú)菌條件下操作)

hPSC細(xì)胞復(fù)蘇：

1、實(shí)驗(yàn)操作步驟：

1.1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL基質(zhì)膠(abs9410)，輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使基質(zhì)膠wan全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，實(shí)驗(yàn)前拿出并置于超凈工作臺(tái)/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時(shí)不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲(chǔ)存，并于1周內(nèi)使用。

注意：

①一支凍存的干細(xì)胞的數(shù)量在1×10⁶cells/mL左右，對(duì)應(yīng)6孔板1孔；

②即用型基質(zhì)膠對(duì)溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2、先將2~3mL的干細(xì)胞培養(yǎng)基加入15mL離心管中備用。

1.3、解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動(dòng)，使其在1~2min內(nèi)快速解凍；

注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時(shí)間。

1.4、離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細(xì)胞培養(yǎng)基的15mL離心管中，將15mL離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后，1000rpm離心3min；

1.5、重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

1.6、接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)包被好的6孔板中，并補(bǔ)全每孔2mL培養(yǎng)體系。

1.7、培養(yǎng)：接種后的6孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈4個(gè)細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；

1.8、換液：從復(fù)蘇的時(shí)間開(kāi)始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

多能干細(xì)胞(PSCs)集落

hPSC 細(xì)胞傳代：

2、實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：

2.1、清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入1mL PBS緩沖液并輕輕晃動(dòng)，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去PBS緩沖液；

2.2、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干細(xì)胞消化液(abs9409)使之覆蓋皿底，并置于37℃培養(yǎng)箱中2~5min；

注意：消化時(shí)間依據(jù)干細(xì)胞生長(zhǎng)密度，消化時(shí)間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)一般建議時(shí)間2-5min。消化過(guò)程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打3~5次，使皿底干細(xì)胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3~5次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無(wú)法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無(wú)法從皿底脫落，需延長(zhǎng)消化時(shí)間。

2.4、離心：1000rpm離心3min，棄上清；

2.5、接種：用干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打細(xì)胞5-10次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補(bǔ)全每孔2mL的培養(yǎng)體系。

注意：吹打細(xì)胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過(guò)10次。

2.6、換液：從傳代的時(shí)間開(kāi)始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

多能干細(xì)胞(PSCs)集落染色圖

hPSC細(xì)胞凍存

3、實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：

3.1、清洗：同2.1；

3.2、消化：同2.2；

3.3、吹打：同2.3；

3.4、離心：同2.4；

3.5、重懸：離心后棄上清，加入2mL ES/iPS細(xì)胞凍存液(abs9412)對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次后，將其加入到凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時(shí)放回4℃冰箱。

3.6、記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時(shí)間、操作者及細(xì)胞批次。

3.7、-80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過(guò)夜。

注意：凍存管放置于-80℃冰箱時(shí)，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8、液氮凍存：24h后將-80℃冰箱中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期凍存。

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