HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells

Keywords: KLF2/4; atherosclerosis; endothelial cells; heart-of-glass 1; mechanobiology.

動(dòng)脈粥樣硬化優(yōu)先發(fā)生在血流模式紊亂（d-flow）的血管分支和彎曲區(qū)域，內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）暴露于致動(dòng)脈粥樣硬化的振蕩、低幅度剪切應(yīng)力（OSS）。相比之下，暴露于穩(wěn)定血流模式（s-flow）下的直向、非分支區(qū)域的血管提供單向、層流、高幅度的剪切應(yīng)力（ULS），促進(jìn)內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)，不會(huì)發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化。ECs 響應(yīng)這些不同的血流模式而發(fā)生的促動(dòng)脈粥樣硬化和抗動(dòng)脈粥樣硬化變化在很大程度上是由血流敏感基因的轉(zhuǎn)錄變化介導(dǎo)的。在 s-flow 中調(diào)節(jié)的基因通常在預(yù)防 EC 功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮作用，而由 d-flow 調(diào)節(jié)的基因通常促進(jìn) EC 功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化。

具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的心臟發(fā)育蛋白1（heart-of-glass homolog 1，HEG1）是一種粘蛋白類膜蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞中富集，在胚胎發(fā)育和血管生成中起關(guān)鍵作用。研究已將其確定為小鼠動(dòng)脈 ECs 中的血流敏感基因。盡管HEG1基因敲除在心臟發(fā)育和血管形態(tài)發(fā)生中的作用已被證實(shí)，但其在成年動(dòng)脈EC功能中響應(yīng)血流和動(dòng)脈粥樣硬化的作用尚不清楚。

鑒于此，美國(guó)佐治亞理工學(xué)院和埃默里大學(xué)Wallace H. Coulter生物醫(yī)學(xué)工程系的研究團(tuán)隊(duì)表明，HEG1 由 s-flow 誘導(dǎo)，被 d-flow 降低，并以 KLF2/4（Krüppel 樣因子 2/4）依賴性方式介導(dǎo) s-flow誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能。研究成果發(fā)表于 Circulation 期刊題為“HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells”。

小鼠PCL手術(shù)后結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈（LCA）暴露于 d-flow，同時(shí)使用繼續(xù)暴露于s-flow 的右側(cè)頸總動(dòng)脈（RCA）作為內(nèi)部對(duì)照。scRNA-seq 分析顯示，Heg1 主要在 ECs 和成纖維細(xì)胞中表達(dá)，且與暴露于 d-flow 的 EC 相比，s-flow 條件下發(fā)現(xiàn)的 EC 簇表達(dá) Heg1 水平顯著升高。這表明，EC 中 Heg1 表達(dá)具有流量敏感性，s-flow 上調(diào)，d-flow 下調(diào)Heg1 表達(dá)。

為了確認(rèn)這些體內(nèi)結(jié)果并表征血流對(duì) HEG1 的調(diào)節(jié)，將 HAECs 暴露于 ULS（15 dyn/cm2，模擬 s-flow）或 OSS （+5/–4 dyn/cm2，1 Hz，模擬 d-flow），靜態(tài)條件下的 HAECs用作對(duì)照。與 OSS 和靜態(tài)條件相比，暴露于 ULS 24 小時(shí)顯著增加了 HEG1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)（圖1 A、B）。令人驚訝的是，在 ULS 下HAECs 的條件培養(yǎng)基中也檢測(cè)到 HEG1 蛋白，但在 OSS 或靜態(tài)培養(yǎng)基中未檢測(cè)到（圖1 C）。為了進(jìn)一步描述這種血流反應(yīng)，進(jìn)行了 2 種不同的時(shí)間過(guò)程研究。結(jié)果表明，HEG1 蛋白在最初前 3 小時(shí)內(nèi)減少，因?yàn)樗陧憫?yīng)ULS時(shí)連續(xù)釋放到介質(zhì)中而沒(méi)有新的轉(zhuǎn)錄，6 小時(shí)后，HEG1 mRNA 和蛋白表達(dá)恢復(fù)，表明新的轉(zhuǎn)錄和翻譯呈血流依賴性（圖1 D-I）。

免疫熒光顯微鏡檢測(cè)表明，與靜態(tài)或 OSS 條件相比，暴露于 ULS 24 小時(shí)增加了 HAECs 中 HEG1 蛋白的表達(dá)（圖1 J）。令人驚訝的是，與在靜態(tài)細(xì)胞和 OSS 細(xì)胞中觀察到的彌漫性染色模式不同，HEG1 染色模式在 ULS 的刺激下顯示出對(duì) ECs 下游的顯著定位。進(jìn)一步測(cè)試發(fā)現(xiàn)，在 ULS 條件下，早在 2 分鐘，HEG1 蛋白就向下游移動(dòng)至細(xì)胞間連接區(qū)域（圖1 K），表明s-flow 可快速誘導(dǎo) HEG1 蛋白易位至 ECs 的下游。這些體外和體內(nèi)結(jié)果表明，血流調(diào)節(jié) HEG1 基因、蛋白質(zhì)表達(dá)、極化定位以及條件培養(yǎng)基中的釋放。

在確定 HEG1 是一種血流敏感基因和因 s-flow 而增加的蛋白質(zhì)后，在流動(dòng)條件下通過(guò) siRNA 敲低在 HAECs 中測(cè)試其功能意義。正如預(yù)期的那樣，ULS 抑制了 HAECs 的單核細(xì)胞粘附、通透性和遷移反應(yīng)，而使用 siRNA 敲低 HEG1 可以阻止這些作用。此外，敲低 HEG1 還阻止了 ULS 介導(dǎo)的對(duì) HAECs 中VCAM1 抑制以及 eNOS 誘導(dǎo)的影響。這些結(jié)果表明，HEG1 在介導(dǎo) s-flow誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

圖1  體外單向?qū)恿骷羟袘?yīng)力（ULS）誘導(dǎo)人主動(dòng)脈EC（HAEC） HEG1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)，刺激蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中并在向下游易位。

接下來(lái)研究了 HEG1 介導(dǎo) EC 中 s-flow 效應(yīng)的機(jī)制，假設(shè) HEG1 調(diào)節(jié) 2 個(gè)關(guān)鍵 s-flow 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子 KLF2/4 的表達(dá)，這反過(guò)來(lái)介導(dǎo) s-flow 的轉(zhuǎn)錄和功能效應(yīng)。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，在用 siHEG1 和 ULS 處理 3 小時(shí)的 HAECs 中檢測(cè) KLF2/4 mRNA 和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HEG1 表達(dá)降低。ULS 顯著誘導(dǎo)了 KLF2/4 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)，而敲低 HEG1 會(huì)顯著減弱 KLF2/4 mRNA 和蛋白表達(dá)。這清楚地證明了 HEG1 在 ULS 調(diào)節(jié) KLF2/4 表達(dá)中的關(guān)鍵作用。

ULS 通過(guò)激活 ECs 中的 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 通路來(lái)調(diào)節(jié) KLF2/4 表達(dá)，但上游血流激活機(jī)制仍然未知。因此，使用特異性藥理學(xué)抑制劑和 HEG1 siRNA 敲低測(cè)試了HEG1通過(guò)ULS調(diào)節(jié)KLF2/4表達(dá)是否也由 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 通路介導(dǎo)。正如預(yù)期，ULS 增加了 ERK5 磷酸化，而敲低 HEG1降低了磷酸化，這提供了 HEG1 調(diào)控 ERK5 的關(guān)鍵證據(jù)，ERK5 是 ULS 介導(dǎo)的 KLF2/4 表達(dá)通路中的關(guān)鍵信號(hào)蛋白。

然后，用 MEKK3（Ponatinib）、MEK5（BIX02189）和 ERK5（XMD8-92）的特異性抑制劑處理 HAECs，檢測(cè) HEG1 與 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路響應(yīng) ULS 的層次關(guān)系。Ponatinib、BIX02189、XMD8-92處理均抑制 ULS 誘導(dǎo)的 ERK5 磷酸化和 KLF2/4 表達(dá)，但對(duì) HEG1 表達(dá)沒(méi)有影響。這些結(jié)果表明，HEG1 是 ULS 誘導(dǎo)的 ECs 中 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路的上游調(diào)節(jié)因子。此外，還發(fā)現(xiàn)HAECs 中過(guò)表達(dá) KLF4 挽救了 ULS 對(duì) eNOS 誘導(dǎo)、VCAM1 抑制和遷移抑制的影響。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 HEG1 通過(guò)調(diào)控 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路介導(dǎo)保護(hù)性 ULS 對(duì) EC 功能的影響。

KRIT1，也稱為腦海綿狀血管畸形1（CCM1），是 MEKK3 激活的抑制劑。盡管已知 KRIT1 和 CCM 復(fù)合物與 MEKK3 的解離會(huì)激活 MEKK3-KLF2/4 通路，但尚不清楚 KRIT1 是否調(diào)節(jié)血流誘導(dǎo)的 MEKK3-KLF2/4 通路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低KRIT1 增強(qiáng)了 ULS 下 ERK5 磷酸化和 KLF2/4 表達(dá)，證明了 KRIT1 在 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路血流激活中的抑制作用（圖2 A）。有趣的是，盡管 ULS 增加了 KRIT1 mRNA 表達(dá)，但 ULS 降低了細(xì)胞裂解物中的 KRIT1 蛋白水平（圖2 B）。

因?yàn)橐阎?KRIT1 結(jié)合 HEG1，且數(shù)據(jù)顯示 HEG1 蛋白響應(yīng) ULS 釋放到培養(yǎng)基中，因此測(cè)試了 KRIT1 蛋白是否也與 HEG1 一起釋放到培養(yǎng)基中。令人驚訝的是，KRIT1 響應(yīng) ULS 而釋放到培養(yǎng)基中，而不是在靜態(tài)或 OSS 條件（圖2 C）。在 ULS 條件下，敲低HEG1 阻止了 KRIT1 的釋放（圖2 D），并且細(xì)胞裂解物中的 KRIT1 蛋白恢復(fù)到對(duì)照水平（圖2 E）。這些結(jié)果表明，KRIT1 以 HEG1 依賴性方式釋放到培養(yǎng)基中。HEG1 與 KRIT1 的免疫共沉淀進(jìn)一步支持了這一結(jié)果，無(wú)論剪切條件如何，它都保持不變（圖2 F）。

這些結(jié)果提出了一個(gè)有趣的假設(shè)，即 ULS 促進(jìn) HEG1 與 MEKK3 抑制劑 KRIT1 一起從 ECs 釋放到培養(yǎng)基中，從而激活 MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4 通路。

圖2  ULS 降低細(xì)胞內(nèi)以 HEG1 依賴性方式釋放的 KRIT1 蛋白水平，刺激 ERK5-KLF2/4 通路。

此外，使用高脂飲食小鼠急性 PCL 模型測(cè)試了他莫昔芬誘導(dǎo)的 EC 特異性 HEG1 敲除對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響，發(fā)現(xiàn)EC 中的 HEG1 敲除顯著加速晚期斑塊的發(fā)展，其特征是脂質(zhì)病變面積、壞死核心面積和 CD68 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加。然后，使用常規(guī)飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化模型，在不進(jìn)行PCL手術(shù)的情況下測(cè)試了他莫昔芬誘導(dǎo)的 EC 特異性 HEG1 敲除對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響，發(fā)現(xiàn)HEG1 敲除小鼠以性別和主動(dòng)脈位置依賴的方式比對(duì)照小鼠出現(xiàn)更多的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。這些結(jié)果表明，HEG1 敲除小鼠的PCL模型中的頸動(dòng)脈和慢性模型中的主動(dòng)脈弓在兩性中都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的動(dòng)脈粥樣硬化惡化。然而，HEG1敲除小鼠在雄性降主動(dòng)脈和主動(dòng)脈竇中表現(xiàn)出適度的致動(dòng)脈粥樣硬化作用，而在雌性中則沒(méi)有，證明了內(nèi)皮 HEG1 缺失的主動(dòng)脈位置和性別依賴性促動(dòng)脈粥樣硬化作用。

最后，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了 HEG1 表達(dá)水平是否與人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的嚴(yán)重程度相關(guān)。結(jié)果表明，在未患病的人冠狀動(dòng)脈的 ECs 中發(fā)現(xiàn)豐富的 HEG1 表達(dá)。然而，與未患病的ECs相比，HEG1 蛋白在晚期動(dòng)脈粥樣硬化病變（范圍 III-IV 和 V-VI）上的 ECs 中表達(dá)降低（圖3 A、B）。這些結(jié)果表明，內(nèi)皮 HEG1 表達(dá)的降低與人冠狀動(dòng)脈的晚期動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展相關(guān)，突出了 HEG1 表達(dá)的臨床相關(guān)性。

圖3    HEG1表達(dá)在晚期斑塊的冠狀動(dòng)脈中顯著降低。

（C）響應(yīng) ECs 中的 d-flow（OSS）和 s-flow（ULS）的HEG1 調(diào)控機(jī)制和作用。在 d-flow 條件下，HEG1 蛋白以低水平表達(dá)，隨機(jī)位于 EC 膜中，并與 KRIT1 結(jié)合，使 MEKK3 失活，導(dǎo)致 KLF2/4 低表達(dá)和致動(dòng)脈粥樣硬化表型。在 s-flow條件下，HEG1 蛋白易位到下游，并與 KRIT1 一起分泌到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致 MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2 通路激活，誘導(dǎo) KLF2/4 表達(dá)。KLF2/4 是s-flow 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)數(shù)百個(gè)靶基因的表達(dá)，從而維持 EC 穩(wěn)態(tài)和動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)。

總之，該研究顯示，HEG1 是一種新型的動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)性、血流敏感蛋白，在 ECs 中以 KRIT1 依賴性方式調(diào)節(jié) MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2-KLF2/4 通路。血流依賴性 HEG1-KRIT-MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2-KLF2/4 通路為抗動(dòng)脈粥樣硬化療法的開(kāi)發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Tamargo IA, Baek KI, Xu C, Kang DW, Kim Y, Andueza A, Williams D, Demos C, Villa-Roel N, Kumar S, Park C, Choi R, Johnson J, Chang S, Kim P, Tan S, Jeong K, Tsuji S, Jo H. HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells. Circulation. 2024 Apr 9;149(15):1183-1201. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.064735. Epub 2023 Dec 15. PMID: 38099436; PMCID: PMC11001532.

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