翌圣雙熒光素酶報告基因檢測服務流程：

目的細胞質粒瞬轉預實驗

當選擇在目的細胞（而非293 工具細胞）中進行驗證實驗時，首先要確認目的細胞的質粒瞬轉效率，以及摸索合適的瞬轉體系，質粒瞬轉效率>40%以上時表明預實驗通過。

轉染正式實驗

a. 將狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的空白細胞用0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)基懸浮成單細胞懸液，細胞計數(shù)后，接種于24 孔培養(yǎng)板中；

b. 培養(yǎng)過夜，觀察細胞生長狀態(tài)。在細胞覆蓋率70%左右時，進行轉染實驗；

c. 轉染2 h 前換液為新鮮的培養(yǎng)基；

d. 轉染取無菌的1.5 mL EP 管，轉染參考轉染試劑使用說明書；

e. 轉染48 h 后收集細胞樣品。

A 細胞樣品收集

a. 轉染后從培養(yǎng)箱中取靶細胞，輕輕吸凈培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次；

b. 棄去PBS，每孔加入100 μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無菌水稀釋而得）；

c. 細胞裂解后，將樣品轉移入EP 管中，-80 度冰箱保存。

B 根據(jù)報告基因檢測試劑盒說明書操作進行檢測

a. 將充分裂解后的裂解產物，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min。離心后將上清液移入新的

EP 管進行后續(xù)檢測。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量，將Renilla Luciferase Assay

Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混勻后室溫放置。

c. 熒光素酶檢測

按照儀器說明書要求將熒光檢測打開，設定參數(shù)，測定時間為10 s，測定間隔為2 s；

將樣品按照20 μL 的體積加入測量管中（保持每次樣品的加樣量一致），

另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻），充分混勻后

測定RLU（Relative light unit），同時設置Cell Lysis buffer 為空白對照孔；

將檢測后的樣品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次，充分

混勻后測定RLU，同時設置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對照孔。