蛋氨酸是一種動物必需的氨基酸，因此必須通過飲食來源獲取。在雞蛋、肉類、魚類以及芝麻、巴西果仁和其他一些植物種子中可以檢測到高含量的蛋氨酸。大多數(shù)水果和蔬菜中蛋氨酸含量較低。除了在蛋白質結構和功能中的傳統(tǒng)作用外，蛋氨酸還作為合成其他氨基酸（如半胱氨酸和牛磺酸）以及重要的抗氧化劑谷胱甘肽的途徑中的底物。蛋氨酸對人類和許多其他物種的代謝至關重要。蛋氨酸在血管生成過程中發(fā)揮重要作用，血管生成是新血管的生長過程。補充蛋氨酸可能對銅中毒有益。然而，許多研究表明，攝入過多的蛋氨酸與癌癥生長有關。

Cell Biolabs的蛋氨酸檢測試劑盒是一種簡單的熒光法檢測，用于在96孔微量滴定板格式中測量生物樣本中總蛋氨酸的含量。每個試劑盒提供足夠的試劑，可進行多達100次檢測（包括空白、蛋氨酸標準品和未知樣本）。通過與已知濃度的蛋氨酸標準品比較來確定樣本中的蛋氨酸濃度。該試劑盒的檢測靈敏度為1.5 µM蛋氨酸。

注意：每個樣本重復需要2次檢測，一次用S-腺苷蛋氨酸合成酶（+AdoMetS）處理，一次不處理（-AdoMetS）。通過計算兩個孔的相對熒光單位（RFU）讀數(shù)的差異來計算蛋氨酸含量。

艾美捷蛋氨酸檢測試劑盒（#MET-5158）檢測原理：

Cell Biolabs的蛋氨酸檢測試劑盒通過測量生物樣本中的總蛋氨酸含量。蛋氨酸和ATP在S-腺苷蛋氨酸合成酶的作用下轉化為S-腺苷蛋氨酸、無機磷酸鹽和焦磷酸鹽。磷酸烯醇丙酮酸和焦磷酸鹽在磷酸丙酮酸二激酶的作用下轉化為丙酮酸。丙酮酸在丙酮酸氧化酶的作用下，在磷酸鹽和氧氣的存在下轉化為乙酰磷酸、二氧化碳和過氧化氫。隨后通過高特異性的熒光探針檢測生成的過氧化氫。辣根過氧化物酶催化探針與過氧化氫之間的反應，它們以1:1的比例結合。樣本與已知濃度的蛋氨酸標準品在96孔微量滴定板格式中進行比較。樣本和標準品孵育30分鐘后，使用標準的96孔熒光平板讀數(shù)器進行讀?。▓D1）。

圖1. 蛋氨酸檢測原理

蛋氨酸檢測試劑盒組分：

盒子1（干冰運輸）

1. 蛋氨酸標準品（部件編號51581C）：1支50 µL試管，濃度為10 mM。

2. ATP（部件編號51583C）：1支50 µL試管，腺苷三磷酸（ATP）濃度為200 mM。

3. AMP（部件編號51584C）：1支50 µL試管，腺苷單磷酸（AMP）濃度為20 mM。

4. PEP（部件編號51585C）：1支50 µL試管，磷酸烯醇丙酮酸（PEP）濃度為100 mM。

5. 熒光探針（部件編號50231C）：1支50 µL試管，溶劑為DMSO。

6. HRP（部件編號234402-T）：1支10 µL試管，100 U/mL的甘油溶液。

7. FAD（部件編號50293C）：1支50 µL試管，黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）濃度為2 mM。

8. TPP（部件編號50294C）：1支50 µL試管，硫胺素焦磷酸（TPP）濃度為2 mM。

9. 丙酮酸氧化酶（部件編號50295C）：1支300 µL試管。

10. AdoMetS（部件編號51587D）：1支150 µL試管，S-腺苷蛋氨酸合成酶（AdoMetS）。

11. PPDK（部件編號51588D）：1支200 µL試管，磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）。

盒子2（干冰運輸）

1. 10X檢測緩沖液（部件編號51582A）：1瓶25 mL。

2. Na?HPO?（部件編號51586A）：1支50 µL試管，磷酸氫二鈉（Na?HPO?）濃度為100 mM。

未提供材料：

1. 蒸餾水或去離子水

2. 10 kDa分子量截止（MWCO）離心過濾器（例如Amicon Ultra 0.5 mL）

3. 標準96孔黑色熒光微量滴定板和/或黑色細胞培養(yǎng)微量滴定板

儲存：

將10X檢測緩沖液和Na?HPO?在室溫下保存。將AdoMetS和PPDK在-80oC下保存。將所有其他組分在-20oC下保存。熒光探針對光敏感，必須相應保存。避免多次凍融循環(huán)。

樣本準備：

- 細胞培養(yǎng)上清液：應避免使用含有丙酮酸的細胞培養(yǎng)基。為了去除不溶性顆粒，以10,000 rpm離心5分鐘。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液。濾液可以直接用于檢測，或根據需要稀釋到PBS中。

  注意：維持pH在7到8之間以獲得最佳工作條件，因為熒光探針在高pH（>8.5）下不穩(wěn)定。

- 組織裂解液：在PBS中超聲或勻漿組織樣本，并在4°C下以10,000 x g離心10分鐘。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液。濾液可以直接用于檢測，或根據需要稀釋到PBS中。

- 細胞裂解液：將細胞重懸于PBS中。在冰上勻漿或超聲處理細胞。離心去除雜質。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液。濾液可以未稀釋或根據需要稀釋到PBS中用于檢測。

- 血清、血漿、唾液或尿液：為了去除不溶性顆粒，以10,000 rpm離心5分鐘。收集上清液，并用10kDa離心過濾器過濾溶液以去除蛋白。收集濾液。濾液可以直接用于檢測，或根據需要稀釋到PBS中。

注意事項：

- 所有樣本應立即進行檢測，或在-80°C下儲存最長1-2個月。根據需要運行適當?shù)膶φ战M。樣本的最佳實驗條件需由研究者自行確定。始終與樣本一起運行標準曲線。

- NADH濃度高于10 µM和谷胱甘肽濃度高于50 µM的樣本會氧化熒光探針，可能導致錯誤的讀數(shù)。為了盡量減少這種干擾，建議在反應中加入超氧化物歧化酶（SOD），最終濃度為40 U/mL（參考文獻2）。

- 避免使用含有DTT或β-巰基乙醇的樣本，因為熒光探針在硫醇（高于10 µM）存在時不穩(wěn)定。

相關產品：

1. MET-5029：丙酮酸檢測試劑盒（熒光法）

2. MET-5001：乳糖檢測試劑盒（熒光法）

3. MET-5013：乳酸檢測試劑盒（熒光法）

4. MET-5023：糖原檢測試劑盒（熒光法）

5. STA-399：游離甘油檢測試劑盒（熒光法）

蛋氨酸檢測試劑盒引用文獻：

1. Finkelstein JD (1990). J. of Nutr. Biochem. 1: 228–37.

2. Votyakova TV, and Reynolds IJ (2001) Neurochem. 79:266.

3. Longchamp A, Mirabella T 2, Arduini A, MacArthur MR, Das A, Trevi?o-Villarreal JH, Hine C,

Ben-Sahra I, Knudsen NH, Brace LE, Reynolds J, Mejia P, Tao M, Sharma G, Wang R, Corpataux

J-M, Haefliger J-A, Ahn KH, Lee C-H, Manning BD, Sinclair DA, Chen CS, Ozaki CK, and

Mitchell JR. (2018) Cell 22:117-129

4. Cavuoto P, Fenech MF (2012). Cancer Treat. Rev. 38: 726–736.

5. Cellarier E, Durando X, Vasson MP, Farges MC, Demiden A, Maurizis JC, Madelmont JC, Chollet

P (2003). Cancer Treat. Rev. 29: 489–499.