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流式細(xì)胞儀技術(shù)原理與操作指南

來源:杭州浩邦生物科技有限公司   2025年03月24日 11:37  
  一、流式細(xì)胞儀技術(shù)原理
 
  流式細(xì)胞儀是一種能夠分離、鑒定和計(jì)數(shù)以單細(xì)胞液體流形式穿過激光束的細(xì)胞的高科技設(shè)備。其工作原理主要基于以下幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn):
 
  流體動(dòng)力學(xué)聚焦原理:
 
  細(xì)胞樣本需制成單細(xì)胞懸液。
 
  在流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室中,細(xì)胞被鞘液包圍,通過精確控制鞘液和樣本流的流速與壓力,使細(xì)胞在鞘液裹挾下呈單列依次通過檢測區(qū)域。這樣確保每個(gè)細(xì)胞能被單獨(dú)檢測,避免細(xì)胞之間的干擾。
 
  激光激發(fā)原理:
 
  當(dāng)細(xì)胞逐個(gè)通過檢測區(qū)時(shí),激光束照射細(xì)胞。
 
  若細(xì)胞中的成分被熒光染料標(biāo)記,就會(huì)吸收激光能量。不同熒光染料因化學(xué)結(jié)構(gòu)差異,有不同激發(fā)和發(fā)射波長。特定染料與細(xì)胞內(nèi)核酸結(jié)合后,在激光照射下會(huì)產(chǎn)生熒光。
 
  熒光檢測原理:
 
  被激發(fā)的熒光信號(hào)由光學(xué)系統(tǒng)收集,其中濾光片可篩選特定波長熒光。
 
  光電探測器將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào),電信號(hào)強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度成正比。
 
  通過分析電信號(hào),可獲取細(xì)胞大小(依據(jù)前向散射光,細(xì)胞越大,前向散射光越強(qiáng))、內(nèi)部復(fù)雜程度(依據(jù)側(cè)向散射光)以及熒光標(biāo)記所代表的生物學(xué)特性(如細(xì)胞表面抗原表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)蛋白含量、DNA含量等)等信息。
 
  二、流式細(xì)胞儀操作流程
 
  流式細(xì)胞儀的操作流程包括樣本制備、儀器校準(zhǔn)、樣本檢測、數(shù)據(jù)分析等步驟,具體如下:
 
  樣本制備:
 
  獲取細(xì)胞樣本,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x合適熒光染料染色細(xì)胞。血液樣本需抗凝處理,可用EDTA抗凝管并稀釋或用密度梯度離心分離特定細(xì)胞群。組織樣本則要機(jī)械破碎或酶消化成單細(xì)胞懸液。
 
  注意染色的溫度和時(shí)間條件,特定抗體染色需在合適溫度下孵育一定時(shí)間。
 
  儀器校準(zhǔn):
 
  在檢測前,要調(diào)節(jié)激光功率、校準(zhǔn)光路,確保激光準(zhǔn)確照射檢測區(qū)域。
 
  設(shè)置光電倍增管電壓以優(yōu)化熒光信號(hào)檢測范圍。
 
  設(shè)置閾值以排除細(xì)胞碎片等干擾,根據(jù)細(xì)胞大小設(shè)前向散射光閾值,小于一定大小的顆粒信號(hào)被排除。
 
  樣本檢測:
 
  將制備好的樣本放于流式細(xì)胞儀樣本架,啟動(dòng)程序。
 
  細(xì)胞在流體動(dòng)力學(xué)聚焦下通過檢測區(qū),產(chǎn)生的熒光和散射光信號(hào)被檢測收集。檢測中可在顯示屏實(shí)時(shí)觀察信號(hào)變化。
 
  數(shù)據(jù)分析:
 
  檢測完成后,用專門軟件處理數(shù)據(jù)。
 
  可根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度和分布對細(xì)胞分類計(jì)數(shù),如繪制熒光強(qiáng)度直方圖顯示不同強(qiáng)度細(xì)胞比例。
 
  也可進(jìn)行雙參數(shù)或多參數(shù)分析,如用散點(diǎn)圖展示兩種抗原表達(dá)水平的細(xì)胞分布。
 
  三、注意事項(xiàng)與維護(hù)保養(yǎng)
 
  注意事項(xiàng):
 
  樣本制備時(shí)需確保細(xì)胞懸液的均勻性和分散性,避免細(xì)胞團(tuán)聚或沉淀。
 
  儀器校準(zhǔn)需定期進(jìn)行,以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
 
  在檢測過程中,需注意觀察信號(hào)變化,及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理異常情況。
 
  維護(hù)保養(yǎng):
 
  定期清潔流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室、激光器等部件,避免污染和堵塞。
 
  定期檢查并更換濾光片、光電倍增管等易損件,確保儀器性能良好。
 
  定期對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和驗(yàn)證,確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
 
  綜上所述,流式細(xì)胞儀是一種基于流體動(dòng)力學(xué)聚焦、激光激發(fā)和熒光檢測原理的高科技設(shè)備。其操作流程包括樣本制備、儀器校準(zhǔn)、樣本檢測和數(shù)據(jù)分析等步驟。在使用過程中,需注意樣本制備的均勻性和分散性、儀器校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性以及檢測過程中的信號(hào)變化。同時(shí),還需定期對儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng),以確保其性能良好和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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