一、實(shí)驗(yàn)原理 

蛋白提取試劑盒通過(guò)溫和裂解細(xì)胞或組織釋放總蛋白，并利用特異性結(jié)合、離心分離及緩沖液洗脫等技術(shù)去除雜質(zhì)（如核酸、脂類等），最終獲得高純度、高活性的目標(biāo)蛋白。  

核心步驟：  

1、裂解：裂解液（含去污劑、蛋白酶抑制劑等）破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，釋放胞內(nèi)蛋白；

2、離心去除碎片：高速離心去除未裂解的細(xì)胞碎片、細(xì)胞核及大分子雜質(zhì)；

3、蛋白純化：通過(guò)離心柱或特異性結(jié)合樹脂選擇性吸附蛋白，雜質(zhì)隨廢液排出；

4、洗脫：低鹽緩沖液或去離子水洗脫目標(biāo)蛋白，避免變性。

二、材料準(zhǔn)備  

試劑盒：蛋白提取試劑盒 （適用于各種動(dòng)物、植物細(xì)胞和組織細(xì)菌樣本） 

自備材料：  

- 新鮮樣本（細(xì)胞、組織等）  

- 預(yù)冷 PBS 緩沖液 （貨號(hào)：abs962） 

- 離心機(jī)（可達(dá)到12,000xg）  

- 冰盒或低溫操作臺(tái)  

- 渦旋振蕩器 （貨號(hào)：abs72001）  

- BCA 蛋白定量試劑盒  （貨號(hào)：abs9232）

- 液氮（組織樣本需速凍）  

三、實(shí)驗(yàn)步驟 （裂解蛋白所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行）

1、樣本處理

- 細(xì)胞樣本：離心收集細(xì)胞（1500xg, 3min），PBS 洗滌 2 次，吸盡殘留液體。  

- 組織樣本：切取 10–50 mg，液氮速凍后研磨成粉末。  

2、裂解 （具體步驟參考不同提取試劑盒說(shuō)明書）

- 加入 200-500μL 預(yù)冷裂解液（含蛋白酶抑制劑），渦旋混勻。  

- 冰上裂解 20-30 分鐘，每隔 5 分鐘渦旋 10 秒。  

3、離心去碎片  

- 12,000xg、4℃ 離心 10 分鐘，取上清（即為總蛋白）轉(zhuǎn)移至新離心管。

-核蛋白需先分離細(xì)胞核：低滲裂解后離心收集核沉淀，再溶解。  

4、蛋白純化

（注：下游做質(zhì)譜或酶活性分析需要4、5步）

- 將離心柱用平衡緩沖液預(yù)處理 5 分鐘，離心棄廢液。  

- 將裂解液上清加入離心柱，12,000 xg 離心 1 分鐘，棄廢液。  

- 加入洗滌緩沖液 500 μL，離心 1 分鐘，重復(fù) 2 次。  

5、洗脫蛋白    

- 加入 50–100 μL 洗脫緩沖液，靜置 2 分鐘后離心 1 分鐘，收集洗脫液（即目標(biāo)蛋白）。

6、蛋白保存

- 將提取的蛋白樣品分裝到小離心管中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求短期保存在 - 20°C 或長(zhǎng)期保存在 - 80°C 冰箱中，避免反復(fù)凍融。

四、結(jié)果分析

1、濃度測(cè)定：  

   - 使用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度，OD562 計(jì)算濃度（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）。 

2、純度評(píng)估：  

   - 分光光度計(jì)檢測(cè) A???/A??? 比值（理想值 1.8–2.0，若 >2.0 提示核酸殘留）。 

3、電泳驗(yàn)證：  

   - SDS-PAGE 電泳檢測(cè)條帶清晰度，無(wú)拖尾或雜帶表明純度較高。

五、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

六、注意事項(xiàng)

1、全程低溫操作（冰上或4℃環(huán)境），防止蛋白降解；

2、裂解液需現(xiàn)用現(xiàn)配，避免反復(fù)凍融；

3、組織樣本需充分勻漿，避免未裂解細(xì)胞殘留。

通過(guò)本方案，可高效提取高純度蛋白，適用于 Western Blot、ELISA、質(zhì)譜分析等下游實(shí)驗(yàn)。

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