確定細胞群體中絲狀肌動蛋白（F-肌動蛋白）含量與游離球狀肌動蛋白（G-肌動蛋白）含量比例可靠且準(zhǔn)確的方法是通過西方印跡法定量分析F-肌動蛋白和G-肌動蛋白的細胞分離組分（1-4）。通常的方法是將細胞在F-肌動蛋白穩(wěn)定緩沖液中勻漿，隨后通過離心分離F-肌動蛋白與G-肌動蛋白庫。然后通過SDS-PAGE分離各組分，并通過西方印跡法定量分析肌動蛋白。最終結(jié)果提供了確定細胞骨架中整合的F-肌動蛋白與細胞質(zhì)中G-肌動蛋白比例的最準(zhǔn)確方法。本試劑盒包含了進行該檢測所需的所有試劑。

G-Actin:F-Actin體內(nèi)測定試劑盒（#BK037）內(nèi)容：

試劑盒包含的材料足夠進行30-100次檢測，具體取決于檢測設(shè)置，并包括用于陽性和陰性對照的試劑。包含以下組分：

裂解液和F-肌動蛋白穩(wěn)定緩沖液

ATP（貨號BSA04）

蛋白酶抑制劑混合物（貨號PIC02）

F-肌動蛋白增強對照溶液

F-肌動蛋白解聚對照溶液

對照G-肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（貨號AKL99）

抗肌動蛋白單克隆抗體（克隆7A8.2.1）（貨號AAN02-S）

SDS樣品緩沖液（5倍濃縮）

DMSO

詳細的操作手冊和廣泛的故障排除指南

G-Actin:F-Actin體內(nèi)測定試劑盒用途包括：

研究藥物對G-肌動蛋白與F-肌動蛋白比例的影響。

研究突變細胞系與其親本細胞系在G-肌動蛋白與F-肌動蛋白比例變化方面的差異。

研究環(huán)境物理變化對G-肌動蛋白與F-肌動蛋白比例的影響。

所需設(shè)備：

能夠達到100,000×g的溫控離心機。理想情況下可接受100 µL樣本體積。雖然該檢測可以適應(yīng)更大體積，但這可能會導(dǎo)致每盒試劑的檢測次數(shù)減少（見第六部分：檢測協(xié)議）。

適合低毫升體積的小型勻漿器或25G針頭和注射器。

SDS-PAGE和西方印跡裝置及試劑，抗小鼠-HRP二抗

示例結(jié)果：

瑞士3T3細胞在DMEM/10% FBS中培養(yǎng)至50%融合度，溫度為37°C，二氧化碳濃度為5%。細胞未處理（泳道1P和1S），或用0.1 µM的肌動蛋白聚合藥物jasplakinolide處理30分鐘，溫度為37°C，二氧化碳濃度為5%（泳道2P和2S）。細胞裂解后，處理成上清液（S）和沉淀（P）組分，并根據(jù)G-肌動蛋白/F-肌動蛋白體內(nèi)檢測試劑盒說明書通過西方印跡法定量分析肌動蛋白。

圖1：在未處理的瑞士3T3細胞中，45%的肌動蛋白為可溶性G-肌動蛋白（1S），55%為不溶性F-肌動蛋白（1P）。這與已發(fā)表的數(shù)據(jù)一致（3）。圖2：在用肌動蛋白聚合藥物jasplakinolide處理的瑞士3T3細胞中，僅有5%的肌動蛋白保留在可溶性G-肌動蛋白組分（2S）中，而95%存在于不溶性F-肌動蛋白沉淀組分（2P）中。泳道50、20和10分別代表50 ng、20 ng和10 ng的G-肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。M代表分子量標(biāo)記（標(biāo)記的分子量顯示在印跡右側(cè)）。

G-Actin:F-Actin體內(nèi)測定試劑盒文獻參考：

Milligan R.A. et al. 1990. Molecular structure of F-actin and location of surface binding sites. Nature 348, 217-221.

Dos Remedios C.G. et al. 2003. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiol. Rev. 83, 433-473.

Phillips D.R. et al. 1980. Identification of membrane proteins mediating the interaction of human platelets. J. Cell Biol. 86, 77-86.

Kim H.R. et al. 2008. Cytoskeletal remodeling in differentiated vascular smooth muscle is actin isoform dependent and stimulus dependent. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, C768-C778.