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【Biorbyt實(shí)驗(yàn)】斑點(diǎn)印跡 Dot Blotting

來(lái)源:武漢博歐特生物科技有限公司   2025年03月27日 15:02  

【Biorbyt實(shí)驗(yàn)】斑點(diǎn)印跡 Dot Blotting

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將各種生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固定基質(zhì)上的過(guò)程稱為“印跡技術(shù)”(Blotting)。生物大分子印跡技術(shù)發(fā)展極為迅速,已廣泛應(yīng)用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。
通常人們將DNA印跡技術(shù)稱為Southern Blotting;RNA印跡技術(shù)稱為Northern Blotting;
蛋白質(zhì)印跡技術(shù)稱為Western Blotting不經(jīng)凝膠的印跡技術(shù)稱為斑點(diǎn)印跡(Dot Blotting)。
蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western Blotting從發(fā)明以來(lái)已有40余年,至今為止依然是“*傳統(tǒng)”且“應(yīng)用*廣”的一種蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè)技術(shù)。但是其實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜,一次性處理樣品能力有限,所得結(jié)果只能進(jìn)行半定量分析,因而限制了其在高通量樣本蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè)中的應(yīng)用。
相比于蛋白質(zhì)印跡技術(shù),斑點(diǎn)印跡分析法(Dot Blotting)通過(guò)簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程,可以完成高通量樣本蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè),但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果依然只能以“半定量”形式體現(xiàn)。
在斑點(diǎn)印跡中,要檢測(cè)到的生物分子不是首先通過(guò)電泳分離出來(lái)的,而是將含有被檢測(cè)分子的混合物直接點(diǎn)在膜上,烘烤固定。然后用核苷酸探針或抗體雜交后檢測(cè)。這種方法耗時(shí)短,可做半定量分析。一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便,市售有多種多管吸印儀。


圖片



斑點(diǎn)印跡 Dot Blotting一般操作步驟:
1、點(diǎn)樣
取硝酸纖維素膜1張,裁成需要的長(zhǎng)度,并在其上畫長(zhǎng)寬為1cm×1cm正方形小格。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照,各取2ul點(diǎn)在膜上正方形小格里。
2、風(fēng)干
將點(diǎn)樣后的膜風(fēng)干,或放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中烘30分鐘。


3、封閉


將膜置于封閉液(5%脫脂奶粉溶于超純水中)室溫封閉1小時(shí)(也可4℃過(guò)夜封閉)。


4、一抗孵育


封閉結(jié)束棄去封閉液后,加入稀釋好的一抗工作液,室溫震蕩孵育1小時(shí)(或4℃過(guò)夜)。


5、洗滌


去除一抗工作液,將硝酸纖維素膜用PBST或TBST緩沖液充分淋洗兩次,每次洗后都盡量棄去溶液。然后再用PBST或TBST緩沖液震蕩洗滌3 次,每次5分鐘。


6、二抗孵育


洗滌完成后,加入稀釋好的二抗工作液,室溫震蕩孵育1小時(shí)。


7、洗滌


去除二抗工作液,將硝酸纖維素膜用PBST或TBST緩沖液充分淋洗兩次,每次洗后都盡量棄去溶液。然后再用PBST或TBST緩沖液震蕩洗滌3 次,每次5分鐘。


8、曝光


取出硝酸纖維素膜,吸水紙略吸去膜上多余溶液后,加入適量的發(fā)光檢測(cè)工作液(吸取溶液A和溶液B按1: 1混勻),使膜上均勻覆蓋,室溫孵育1-2分鐘。
抖去多余的顯色劑,用保鮮膜將硝酸纖維素膜覆蓋,平整無(wú)氣泡,并放在曝光夾上,然后取適當(dāng)大小的膠片覆蓋在薄膜上,關(guān)夾曝光。
根據(jù)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的亮度,確定大致曝光時(shí)間。一般情況下,如果樣品亮度肉眼可見(jiàn)且較強(qiáng),那么初次曝光時(shí)間應(yīng)較短,一般選3-5秒:如果樣品亮度肉眼不可見(jiàn),則初次曝光時(shí)間應(yīng)略長(zhǎng)一些,一般選擇1分鐘。


9、顯影


曝光后,取出膠片浸于顯影液中,在紅光下觀察,直到膠片上的樣品點(diǎn)不再變化為止(約1.5分鐘),取出膠片在水中涮洗一下(此步驟避免顯影液與定影液混合,降低定影液使用效率),再放入定影液中,當(dāng)膠片本底呈現(xiàn)藍(lán)色透明后,即可取出膠片進(jìn)行流水沖洗,洗凈后晾干即可。
      Biorbyt團(tuán)隊(duì)可以為您提供斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)所需的試劑,包括超過(guò)2800多種的抗體和400多種蛋白,用于支持您的研究。請(qǐng)說(shuō)出您的需求,我們一定努力超出您的期望!

BIORBYT簡(jiǎn)介

英國(guó)biorbyt 成立于2011年,總部位于英國(guó)劍橋,系*界*先地位的高品質(zhì)生命科學(xué)試劑供應(yīng)商,致力于為生命科學(xué)領(lǐng)域的科研人員提供高品質(zhì)的產(chǎn)品和專業(yè)的技術(shù)服務(wù)。Biorbyt 專注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域研究,主要產(chǎn)品有抗體、小分子、ELISA試劑盒、蛋白等。Biorbyt 與世界*名高校、研究所、制藥公司、生物科技公司和醫(yī)院等客戶建立了長(zhǎng)期穩(wěn)定的合作關(guān)系,產(chǎn)品銷往*球。Biorby 已通過(guò)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織 (ISO 9001)認(rèn)證,并且于2021年榮獲了“英國(guó)*王企業(yè)獎(jiǎng)”。 


Biorbyt Ltdwas established in 2011, based in Cambridge, UK. We are committed to providing high quality products and professional technical services to researchers in the life science sector. Biorbyt is a leading, global, high-quality reagent supplier specialising in life science and biotechnology research. The main products offered by Biorbyt include antibodies, small molecules, ELISA kits, and proteins. Supplying on a global basis, Biorbyt has established long-term, stable, co-operative relationships with world-renowned universities,research institutes, pharmaceutical & biotechnology companies, as well as hospitals. Biorbyt have received ISO 9001 certifications,and won the "Queen's Awards for Enterprise" in 2021



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