Mechanoreceptor Piezo1 channel-mediated interleukin expression in conjunctival epithelial cells: Linking mechanical stress to ocular inflammation

Keywords: CREB; Conjunctival epithelial cells; Inflammation; Mechanical stress; Neutrophils; Piezo1; p38 MAPK.

據(jù)報(bào)道，揉眼睛會(huì)顯著惡化各種眼部疾病。長(zhǎng)期過(guò)度揉眼時(shí)對(duì)角膜產(chǎn)生的機(jī)械壓力導(dǎo)致角膜變薄，這種情況稱為圓錐角膜。許多研究強(qiáng)烈表明，圓錐角膜可能是一種炎癥性疾病。眼部炎癥是一種多方面的反應(yīng)，通常由各種刺激物引發(fā)。常見的過(guò)敏原和病原體，如花粉、寵物皮屑、真菌、塵螨和病毒，以及煙霧和化學(xué)物質(zhì)等環(huán)境刺激，都會(huì)在眼表引發(fā)免疫反應(yīng)。

圓錐角膜患者和佩戴隱形眼鏡人群的淚液研究（隱形眼鏡被認(rèn)為會(huì)對(duì)眼表組織產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力）已經(jīng)確定了促炎細(xì)胞因子水平的升高，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （MMP-9）。重要的是，研究已經(jīng)證明，揉眼本身會(huì)急性誘導(dǎo)正常受試者淚液中IL-6、IL-8 和 TNF-α 等細(xì)胞因子的釋放，這些細(xì)胞因子在眼表炎癥中起著至關(guān)重要的作用。因此，由摩擦眼睛和佩戴隱形眼鏡引起的機(jī)械應(yīng)力有可能通過(guò)激活機(jī)械敏感離子通道在眼表誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

Piezo蛋白家族之一，Piezo1 主要在非神經(jīng)元組織中表達(dá)，可以感知各種應(yīng)力，包括壓應(yīng)力、拉伸應(yīng)力和剪切應(yīng)力等，并參與調(diào)控血管發(fā)育、血管收縮、紅細(xì)胞體積等諸多生理過(guò)程。最近的研究報(bào)道表明，Piezo1 通道通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，與炎癥反應(yīng)和各種病理狀況有關(guān)，突出了它們?cè)跈C(jī)械感覺之外的作用。然而，Piezo1 在眼部組織中的功能及其與眼部炎癥的關(guān)系仍不清楚。

近日，日本昭和大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院生理學(xué)系及眼科系課題組在最新研究中闡明了機(jī)械應(yīng)力可誘導(dǎo)或加重眼部炎癥這一先前懷疑但尚未明確的現(xiàn)象，并重點(diǎn)關(guān)注了 Piezo1 通道在結(jié)膜上皮細(xì)胞中的作用及其潛在機(jī)制。研究成果發(fā)表于 The Ocular Surface 期刊題為“Mechanoreceptor Piezo1 channel-mediated interleukin expression in conjunctival epithelial cells: Linking mechanical stress to ocular inflammation”。

首先，檢查了機(jī)械敏感的 Piezo1 通道的激活是否會(huì)改變炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。將Piezo1 特異性激動(dòng)劑 Yoda1 和幾種過(guò)敏原應(yīng)用于培養(yǎng)的人結(jié)膜上皮細(xì)胞（HConjECs），發(fā)現(xiàn) Yoda1 明顯將 HConjECs 中的 IL-6 和 IL-8 mRNA 水平提高到與真菌提取物 （Alternaria alternata）誘導(dǎo)的水平相似。在誘導(dǎo)白細(xì)胞介素表達(dá)的藥物中，Yoda1 和真菌提取物都激活了信號(hào)蛋白 p38 MAPK 和轉(zhuǎn)錄因子 CREB。這些數(shù)據(jù)表明，機(jī)械敏感的 Piezo1 通道的激活可以在 HConjECs 中誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子，如 IL-6 和 IL-8，其水平與真菌提取物通過(guò)常見的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路誘導(dǎo)的水平相似。

然后，確定功能性 Piezo1 通道是否在 HConjECs 中表達(dá)。RT-PCR 和 Western blot 分析清楚地表明 HConjECs 表達(dá) Piezo1 通道。細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 的成像顯示，在 Yoda1 刺激 Piezo1 通道后，[Ca2+]i立即顯著增加。與 IL-6 表達(dá)和 p38 MAPK/CREB 的激活相同，在測(cè)試的過(guò)敏原中，只有真菌提取物誘導(dǎo) [Ca2+]i 顯著升高，進(jìn)一步支持其是共享信號(hào)通路。這表明，HConjECs 表達(dá)一個(gè)功能性機(jī)械敏感的 Piezo1 通道，該通道在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

為了證實(shí)通過(guò)Piezo1通道和p38 MAPK和CREB激活的 Ca2+ 內(nèi)流參與IL-6上調(diào)，使用p38 MAPK 特異性抑制劑 SB203580 和 Ca2+ 螯合劑預(yù)處理 HConjECs，發(fā)現(xiàn)SB203580 成功阻斷了p38 MAPK 的激活（圖1 A、B）。重要的是，阻斷 p38 MAPK 激活顯著抑制了 Piezo1 通道激活誘導(dǎo)的 CREB 激活（圖1 A-C）和 IL-6 蛋白/mRNA 上調(diào)（圖1 D、E）。此外，BAPTA-AM 通過(guò)螯合細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 顯著降低了 Yoda1 誘導(dǎo)的 IL-6 mRNA 上調(diào)（圖1 F）。這些數(shù)據(jù)表明，活化的 Piezo1 通道通過(guò) Ca2+ 內(nèi)流和 p38 MAPK-CREB 通路的激活來(lái)誘導(dǎo) IL-6 表達(dá)。

圖1      p38 MAPK 的激活和 [Ca2+]i 的升高對(duì) Yoda1 誘導(dǎo)的 IL-6 上調(diào)至關(guān)重要。

免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，p38 MAPK 和 CREB 在 Yoda1 處理后 15 分鐘被顯著激活（磷酸化），并在 HConjECs 的細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)（圖2 A、B）。在 Piezo 通道激活后 6 小時(shí)，還觀察到 IL-6 蛋白表達(dá)細(xì)胞激增（圖2 C）。IL-6 的免疫反應(yīng)性與順式高爾基體標(biāo)志物 GM130 共定位（圖2 D），這種共定位表明，觀察到的 IL-6 蛋白是響應(yīng) Yoda1 刺激新合成的。SB203580 預(yù)處理后，p38 MAPK 和 CREB 的激活以及IL-6 蛋白的表達(dá)明顯減少（圖2 A、B、C）。這些數(shù)據(jù)表明，Piezo1 通道的激活誘導(dǎo) p38 MAPK 磷酸化及易位到細(xì)胞核，隨后刺激 CREB 激活和 IL-6 上調(diào)。

接下來(lái)，為了確認(rèn) Piezo1 在 Yoda1 誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中的功能作用，敲低 HConjECs 中 Piezo1 的表達(dá)。結(jié)果表明，Yoda1 處理對(duì)照細(xì)胞中 [Ca2+]i升高及 p38 MAPK 和 CREB  磷酸化，這在 PIEZO1 敲低細(xì)胞中被顯著抑制。此外，PIEZO1 敲低顯著降低了 Yoda1 誘導(dǎo)的 IL-6 mRNA 表達(dá)的上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，HConjECs 中Yoda1 誘導(dǎo)的 [Ca2+]i 升高、細(xì)胞核 p38 MAPK/CREB 激活和 IL-6 上調(diào)嚴(yán)重依賴于 Piezo1。

圖2     Piezo1 激活顯著誘導(dǎo) HConjECs 中磷酸化-p38 MAPK 和磷酸化-CREB 的核表達(dá)以及 IL-6 蛋白的胞質(zhì)表達(dá)，這嚴(yán)重依賴于 p38 MAPK 激活。

進(jìn)一步地，實(shí)驗(yàn)確定了機(jī)械刺激是否真的導(dǎo)致了 Yoda1 依賴性 Piezo1 通道激活誘導(dǎo)的現(xiàn)象。將培養(yǎng)的 HConjECs 拉伸至 120 %，發(fā)現(xiàn)拉伸刺激誘導(dǎo) p38 MAPK-CREB 通路在沒有Yoda1處理的情況下以細(xì)胞外 Ca2+ 依賴的方式激活（圖3 B、C）。在 HConjECs 中拉伸刺激 6 小時(shí)后也證實(shí)了 IL-6 上調(diào)，其被SB203580 阻斷（圖3 D）。GsMTx4 是一種機(jī)械敏感的離子通道抑制劑，可顯著抑制拉伸誘導(dǎo)的 p38 MAPK、CREB 的激活和 IL-6 mRNA 表達(dá)，但未全部抑制這些反應(yīng)（圖3 E-H）。這些數(shù)據(jù)表明，HConjECs 中機(jī)械刺激通過(guò) [Ca2+]i 升高和 p38 MAPK/CREB 激活誘導(dǎo)IL-6表達(dá)。

圖3    機(jī)械拉伸刺激誘導(dǎo) HConjECs 中 p38 MAPK/CREB 激活和 IL-6 上調(diào)。

最后，實(shí)驗(yàn)旨在確定大鼠結(jié)膜上皮中 Piezo1 受體的激活是否顯示出與體外培養(yǎng)的 HConjECs 中觀察到的現(xiàn)象相似。將 Yoda1 滴注到眼睛 5-10 分鐘后，觀察到大鼠結(jié)膜上皮中磷酸化-p38 和磷酸化-CREB 的表達(dá)顯著增加。Piezo1 通道激活后 3 小時(shí)，IL-6 免疫反應(yīng)性也顯著增加。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，Piezo1 激活上調(diào)大鼠結(jié)膜上皮中的 p-p38 MAPK、p-CREB 和 IL-6水平，與體外培養(yǎng)的 HConjECs 現(xiàn)象相似。

此外，還觀察到大鼠結(jié)膜上皮中 Piezo1 受體刺激后 24 小時(shí)，中性粒細(xì)胞、髓過(guò)氧化物酶（MPO）陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。然而，在將 Yoda1 滴注到眼睛后 3 小時(shí)和 24 小時(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞主要堿性蛋白（MBP）陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量沒有變化。這些數(shù)據(jù)表明，結(jié)膜中 Piezo1 通道的激活誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到結(jié)膜上皮細(xì)胞，而不影響嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖4    圖形概要

機(jī)械敏感的 Piezo1 通道的激活通過(guò)升高 [Ca2+]i 以及 p38 MAPK 和轉(zhuǎn)錄因子 CREB 的激活誘導(dǎo)結(jié)膜上皮細(xì)胞中IL-6的表達(dá)。機(jī)械應(yīng)力通過(guò)它刺激 Piezo1 通道和 Ca2+ 內(nèi)流，誘導(dǎo) p38 MAPK 的激活。轉(zhuǎn)錄因子 CREB 在 p38 MAPK 激活后被磷酸化，然后促進(jìn) IL-6 轉(zhuǎn)錄。

幾乎每個(gè)人都知道我們不應(yīng)該揉眼睛，并經(jīng)常把這個(gè)建議歸因于不干凈的手指有感染的風(fēng)險(xiǎn)或?qū)ρ郾泶嬖跐撛趽p害。然而，該研究表明，揉眼可以誘導(dǎo)結(jié)膜中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的結(jié)果以及 Piezo1 激活后觀察到的細(xì)胞反應(yīng)與真菌暴露引發(fā)的結(jié)果相似，這表明結(jié)膜的機(jī)械刺激可以引發(fā)類似于感染的炎癥反應(yīng)。這意味著感染引起的眼癢可能會(huì)促使揉眼，從而增強(qiáng)炎癥防御機(jī)制。然而，該研究與其他研究的結(jié)果表明，習(xí)慣性揉眼或過(guò)敏癥狀引起的過(guò)度揉眼會(huì)導(dǎo)致過(guò)度活躍的炎癥反應(yīng)，增加患上或加劇眼部炎癥或炎癥相關(guān)疾?。ㄈ鐖A錐角膜）的風(fēng)險(xiǎn)。因此，提高對(duì)持續(xù)揉眼風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)對(duì)于預(yù)防眼部炎癥的發(fā)生和進(jìn)展至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)：Fukuoka S, Adachi N, Ouchi E, Ikemoto H, Okumo T, Ishikawa F, Onda H, Sunagawa M. Mechanoreceptor Piezo1 channel-mediated interleukin expression in conjunctival epithelial cells: Linking mechanical stress to ocular inflammation. Ocul Surf. 2025 Jan 6;36:56-68. doi: 10.1016/j.jtos.2025.01.001. Epub ahead of print. PMID: 39778715.

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