引 言

DNase I的來(lái)源

DNase I最初主要從牛胰腺中純化得到。牛胰腺是RNase A的豐富來(lái)源，因此對(duì)于牛胰來(lái)源的DNase I去除RNase A的工藝非常關(guān)鍵；牛胰來(lái)源的DNase I的優(yōu)勢(shì)在于，來(lái)源廣，能實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，酶活高等優(yōu)點(diǎn)；但是牛胰腺中可能含有其他雜質(zhì)和污染物，增加了純化的難度；另一方面，有些生物制品不能接受動(dòng)物來(lái)源的DNase I，這時(shí)需要重組來(lái)源的DNase I來(lái)替換。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)始采用重組技術(shù)生產(chǎn)DNase I。目前，常見(jiàn)的重組表達(dá)系統(tǒng)包括酵母畢赤酵母和大腸桿菌（E. coli）菌株。這種生產(chǎn)方式可以降低污染RNase的水平。在重組大腸桿菌菌株中表達(dá)的DNase I，不含RNase，可用于各種RNA樣品的處理，如RNA提取或反轉(zhuǎn)錄前去除基因組DNA，體外轉(zhuǎn)錄去除模板DNA等。重組技術(shù)的運(yùn)用使得DNase I的生產(chǎn)更加高效、安全，并且能夠更好地滿足不同實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用的需求。但是重組技術(shù)生產(chǎn)DNase I既要實(shí)現(xiàn)高酶活，又要放大發(fā)酵工藝，確保低殘留，這種工藝實(shí)現(xiàn)的難度較大，成本較高。

DNase I的作用原理

DNase I首先通過(guò)靜電相互作用與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的磷酸骨架結(jié)合。

與DNA分子結(jié)合后，DNase I的活性中心結(jié)構(gòu)域與DNA分子作用。使底物分子的磷酸二酯鍵斷裂，生成相應(yīng)的寡核苷酸片段。

DNase I的活性依賴于鈣離子（Ca2?），并能被鎂離子（Mg2?）或二價(jià)錳離子（Mn2?）激活。

DNase I的用途

在RNA提取過(guò)程中，常常會(huì)混入基因組DNA，這些DNA會(huì)對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。例如，在進(jìn)行mRNA表達(dá)量分析、轉(zhuǎn)錄組分析、RT—qPCR等下游實(shí)驗(yàn)時(shí)，DNA的存在會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。DNase I可以有效地去除RNA樣品中的DNA污染，提高RNA的純度。在提取RNA時(shí)，可以在裂解細(xì)胞后加入適量的DNase I，并在適宜的條件（37℃、pH=7—8）下進(jìn)行孵育一段時(shí)間，DNase I將會(huì)發(fā)揮作用，特異性降解DNA分子，再進(jìn)行后續(xù)的RNA提純處理。該應(yīng)用場(chǎng)景下，牛胰來(lái)源和重組來(lái)源都適用，牛胰來(lái)源的應(yīng)用相對(duì)更廣泛。

在體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中，常用T7、T3、SP6等RNA聚合酶進(jìn)行RNA合成。然而，合成后的RNA可能會(huì)有DNA殘留，若用于mRNA疫苗生產(chǎn)制作，則必須用DNase I去除模板DNA殘留，且不能引入會(huì)引起免疫反應(yīng)的雜質(zhì)。例如，在制備mRNA疫苗時(shí)，需要確保RNA樣品中不含有任何DNA污染，否則可能會(huì)影響疫苗的安全性和有效性。DNase I能夠高效地去除模板DNA，保證RNA疫苗的質(zhì)量。

1. rRNAq去除，常應(yīng)用于RNA建庫(kù)測(cè)序
在酶法rRNAq去除實(shí)驗(yàn)步驟中，單鏈DNA探針和rRNA分子雜交結(jié)合；RNase H降解雜交的rRNA； DNase I降解DNA 探針；
2、DNase I足跡實(shí)驗(yàn)（DNase I footprinting），其原理是蛋白結(jié)合在DNA片段上，能保護(hù)結(jié)合部位不被DNase I破壞，DNA分子經(jīng)酶切作用后遺留下該片段（即“足跡”)，進(jìn)而可以確定其序列。
3. 缺口平移（nick translation）；該方法是DNase I與E.coli DNA Polymerase I的聯(lián)合作用實(shí)現(xiàn)的。
4. 細(xì)胞凋亡TUNEL檢測(cè)。

DNaseI選擇指南