北京慧德易教您色譜柱預(yù)防性保護與柱壽命的延長

    通常，一根色譜柱在分析數(shù)千個樣品之后性能仍然保持良好，但也有的色譜柱僅分析不多的樣品后幾乎就報廢了。影響色譜柱壽命和其它問題的因素很多，而有些因素是操作者很難控制的，如果被分析的樣品（如分析生物樣品），怎么凈化樣品也是“臟”的，對于色譜柱的影響是非常大的。然而采取下列措施后，在多數(shù)情況下總能夠人為地減少色譜柱上故障，達(dá)到延長壽命的目的。

1、加流路過濾器和保護柱

    流路過濾器緊靠進(jìn)樣閥后面，位于分析柱前。0.5μm燒結(jié)不銹鋼片夾在死體積很小的套子中，擋住來源于樣品和進(jìn)樣閥墊圈的微粒入柱。因為每個樣品都過濾既費事又帶來誤差，樣品量少過濾更困難，因此流路上裝過濾器是比較省事的辦法。也可以在流路加上保護柱，放在流路過濾器和分析柱之間，或者代替流路過濾器。保護柱的使命是收集阻塞色譜柱進(jìn)口的來自樣品的化學(xué)“垃圾”。這種垃圾zui終降低柱效能。保護柱是消耗品，分析50～100個比較臟的樣品之后就要調(diào)換新的。保護柱應(yīng)該是小體積，用分析柱的同種填料填裝。保護柱使用得當(dāng)，對分離無影響，好像未裝保護柱一樣。有些廠商的商品將保護柱和流路過濾器連在一個單元內(nèi)，使用起來非常方便。自己填裝保護柱都是用短柱、不超過3cm長，內(nèi)徑2～3mm，用較大粒度的填粒（15～20μm）干法填裝，會使分析柱效略微有所降低。

2、避免高壓沖擊

    一般色譜柱都能經(jīng)得起高壓，但經(jīng)不起突然變化的高壓沖擊。引起高壓突然沖擊，主要是因樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動、泵起動快、柱切換操作等。轉(zhuǎn)動六通進(jìn)樣閥時從泵到柱的液流會瞬時切斷。在閥的泵側(cè)壓力升高，在閥的柱側(cè)壓力降低（變化超過20％）。閥轉(zhuǎn)到底后壓力突然沖擊一下恢復(fù)正常。手動進(jìn)樣閥的變化不大，自動進(jìn)樣閥比較慢，可能造成壓力沖擊，可用氦氣代替空氣驅(qū)動進(jìn)樣閥。因氮壓縮系數(shù)小。另外泵起動不應(yīng)過快，可分步操作。如用3mL／min流速，先從lmL／min到2mL／min，然后再3mL／min，每個間隔應(yīng)大于20s。柱切換技術(shù)的應(yīng)用也很廣泛，切換過程中在色譜柱的入口處壓力在零到很大數(shù)字之間變化，會很快使柱報廢。

3、分離條件

    多數(shù)色譜柱有很寬的試驗條件范圍，但具體應(yīng)用又受到限制，主要是pH值、柱溫和流動相的選擇。

    硅膠為基質(zhì)的鍵合相要求PH在2.5～7之間，pH的流動相能“溶解”硅膠，使鍵合相流失。結(jié)果非堿性組分的保留不斷減少，堿性組分的保留增加，引起堿性組分峰變寬。如果一定要用高或低pH的流動相，可加預(yù)柱（飽和柱）。預(yù)柱裝在泵和進(jìn)樣閥之間，用分析柱相同的填料填裝，或者用普通硅膠。硅膠飽和了流動相，減少了分析柱填料的損失。預(yù)柱不要求柱效高，用價格低的一般硅膠疏松地填裝，按期檢查硅膠的溶解情況。用預(yù)柱也有不利的影響，即新流動相難以平衡，保留時間不穩(wěn)定或穩(wěn)定慢。使用了預(yù)柱一定要加流路過濾器，以防止硅膠微粒引起的麻煩。

    以硅膠為基質(zhì)的柱和陰離子交換柱超過60℃后，會增加對流動相中化學(xué)物質(zhì)的吸附。在高溫下用小顆粒柱引起柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。在40℃以上使用3μm柱，70℃以上使用5μm柱，會使值降低50％。

    有些流動相中的溶劑不能用于某些色譜柱，如小顆粒的聚苯乙烯填料不能用于非水的排阻色譜。另一方面，有些色譜柱與某些溶劑（如四氫呋喃）一旦達(dá)到平衡，不要隨意改用其它溶劑。有關(guān)這些特殊填料，可以參見有關(guān)資料。

    水溶性流動相會引起微生物生長而造成阻塞色譜柱。色譜柱應(yīng)存放在純有機溶劑或加了50％有機溶劑的水中。凝膠色譜柱可存放在水溶性緩沖液中，同時加0.01％疊氮鈉以防止微生物的生長。

4、凈化樣品

    用溶劑溶解的樣品，多數(shù)組分在一定的時間內(nèi)能*從柱中流出來，不會造成危害。有些樣品可能含有微粒物質(zhì)，樣品中的某種組分（如蛋白質(zhì)）在柱頭上沉積下來，組分在固定相上保留很強，溶劑帶走柱填料等，這些都會造成柱效能下降或?qū)χ鶋勖挠绊?，有必要采取措施防止柱變壞?/p>

    如在光線照射下觀察樣品是渾濁的或帶有乳白色，進(jìn)樣前必須要過濾．雖然流路上裝有過濾器和保護柱，但不能代替樣品的前處理，樣品中過多的微粒會使過濾器和保護柱超載，很快阻塞，或者微粒進(jìn)入分析柱，所以在進(jìn)樣前必須過濾樣品。

    若懷疑樣品與流動相混合有沉淀而對色譜柱有阻塞，應(yīng)先試驗一下，看樣品溶液加入流動相中有無變渾或乳白色出現(xiàn)。如果進(jìn)樣后壓力突然增加而后又慢慢減小，表明樣品中有微?；虬l(fā)生沉淀。如有沉淀要設(shè)法改變分離條件，包括換樣品溶劑和流動相或處理樣品去掉不溶物質(zhì)。應(yīng)盡量用小體積的樣品。

    有些樣品能很強地吸附在柱填料上，這樣會降低塔板數(shù)，改變樣品的保留物質(zhì)外，還要加保護柱，定期清洗色譜柱。有時因為疏忽，用對柱有害的溶劑溶解樣品，比如用6mol／L的氫氧化鈉溶解樣品，這樣的樣品只要進(jìn)50～100μL到硅膠基質(zhì)柱中，硅膠就很快溶解而使柱報廢。在這種情況下，應(yīng)立即中和樣品，或除去原溶劑中的有害成分。

5、用強溶劑定期沖洗色譜柱    每次工作結(jié)束，用強溶劑沖洗柱是良好的習(xí)慣?？捎眉状肌⒁译鏇_反相柱，沖去留在柱上的強吸附組分。用甲醇水為流動相時也應(yīng)沖洗。沖洗的程序在以下章節(jié)中介紹。柱頭的燒結(jié)不銹鋼濾片，要求平整，死體積小，孔徑適當(dāng)（2～5μm）。過濾片選擇不好會改變色譜峰形，增加阻力或起不到阻擋污染物的作用（填料很快變色）。

    此外，對色譜柱硬件的保養(yǎng)也不可忽視．實際操作中應(yīng)注意以下幾點：①接頭要配套，用同一廠商的組接件；②接頭之間、柱壓帽螺母與密封卡套之間無微粒（填料），否則收緊時容易咬死；③密封卡套與柱管一次性卡緊后再也不能松動，所以拆開柱頭再上緊時要小心，不能使卡套移動，原來柱端的不銹鋼濾片和墊片的厚度和強度也不能改變（改變這些附件的性能就促使卡套移動；④接頭等組接件不要擰得過緊，適當(dāng)上緊后接上泵試驗，分步擰緊，直到不漏為止．還有非常重要的是色譜柱硬件的損壞往往會造成不可挽回的損失。

綜上所述，如何保護良好的柱性能與柱壽命：

O認(rèn)真閱讀色譜柱使用說明書；

O使用填充良好的色譜柱；

O盡量減少壓力波動，避免機械及熱沖擊；

O使用保護柱及在線過濾器；

O經(jīng)常以強溶劑沖洗色譜柱；

O充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質(zhì)微粒與強保留成分；

O用穩(wěn)定的固定相（C18zui穩(wěn)定）：

O在中等pH值操作時（6～8），用有機緩沖溶液；

O色譜柱使用溫度小于40℃；

O硅膠基質(zhì)的色譜柱，應(yīng)保持流動相的pH值范圍在3.0～8.0；

O在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；

O流動相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意用95：5的水及有機溶劑過濾，有機溶劑不能低于5％；

O過夜或貯存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機溶劑流動相保存（乙腈）。

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