慧德易教您如何選擇色譜柱的保護(hù)柱  

    怎樣選擇色譜柱的保護(hù)柱，但又不影響分離分析?這是色譜工作者經(jīng)常提出的一個(gè)問(wèn)題。通常，在選擇保護(hù)柱之前首先要考慮的是樣品是否清潔。對(duì)于大部分分析工作者來(lái)說(shuō)，一支lcm長(zhǎng)的保護(hù)柱便能提供對(duì)柱子的保護(hù)，工作中發(fā)現(xiàn)要經(jīng)常更換1cm的保護(hù)柱，那么應(yīng)選擇2cm或3cm長(zhǎng)的保護(hù)柱。保護(hù)柱越長(zhǎng)，自然所裝填的色譜填料越多，則其越能避免污染物進(jìn)入分析色譜柱的機(jī)會(huì)。當(dāng)然，隨著保護(hù)柱的長(zhǎng)度加長(zhǎng)，樣品的保留時(shí)間會(huì)比使用短保護(hù)柱長(zhǎng)。

一般來(lái)說(shuō)，保護(hù)柱的內(nèi)徑與分析色譜柱的內(nèi)徑相同或相當(dāng)即可。

   保護(hù)柱的填料裝填方式也很重要。目前有薄膜裝填法的保護(hù)柱，使用過(guò)程很簡(jiǎn)單方便，而且可以在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行干裝。但是，其zui大的缺點(diǎn)是不經(jīng)濟(jì)，特別是針對(duì)中國(guó)的具體情況，一次性使用相對(duì)費(fèi)用較高。另外，薄膜裝填法的保擴(kuò)性所裝填的色譜填料有限，只能提供很有限的保護(hù)作用；不過(guò)也因?yàn)樗b填的色譜填料較少，保護(hù)柱的長(zhǎng)度也較短，所以對(duì)分析樣品的保留時(shí)間的影響也很小。

    另一種保護(hù)柱結(jié)構(gòu)其實(shí)質(zhì)是縮短了的色譜分析柱，設(shè)計(jì)方式上有直連式、手緊式或整體式。整體式設(shè)計(jì)是由色譜柱的生產(chǎn)廠商直接安裝在色譜分析柱上的，必須與色譜分析柱一同訂貨，可以非常方便地使用，但不能夠被修改。直連式結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可在任何時(shí)候由色譜工作者來(lái)安裝連接，可以與任何品牌的色譜分析柱連接使用，而且還可以根據(jù)樣品的相關(guān)情況選擇不同的保護(hù)柱一樣，只是在連接時(shí)不需要借助扳手等工具，直接用手上緊即可。另外從保護(hù)柱結(jié)構(gòu)的角度看，保護(hù)柱的結(jié)構(gòu)又分為是否可以更換保護(hù)柱柱芯?，F(xiàn)在大多數(shù)的保護(hù)柱均可以更換保護(hù)柱柱芯，可以降低保護(hù)柱的使用成本。大多數(shù)人是根據(jù)色譜分析柱的填料選擇保護(hù)柱的填料，正常情況下可以選擇與分析色譜柱一樣的色譜填料。但是，根據(jù)實(shí)際的分析工作，也可不必與分析色譜柱的填料*相匹配。

    對(duì)于選擇保護(hù)柱的原則是：在滿足分析分離要求的前提條件下，盡可能地選擇較短的保護(hù)柱結(jié)構(gòu)，盡可能選擇對(duì)分離樣品小一些保留性的填料。

六、故障與解決的方法

    選樣了一根好的柱子，再加上有效的維護(hù)與預(yù)防，可以避免不少意外故障的發(fā)生。當(dāng)然誰(shuí)也不能保護(hù)色譜柱“永遠(yuǎn)”不出故障，任何一根色譜柱zui終都會(huì)因?yàn)橹陆抵钡綀?bào)廢。柱損壞的標(biāo)志是：①塔板數(shù)下降；②峰形改變；③壓力增加；④保留時(shí)間變化。有時(shí)往往是幾種情況伴隨著同時(shí)發(fā)生。

1、塔板數(shù)下降

    在色譜柱使用過(guò)程中，塔板數(shù)會(huì)不斷下降．一般情況下，進(jìn)2000個(gè)樣品后柱效N值要降低50％，（但也不能一概而論），而用C₁₈，柱梯度分析氨基酸，進(jìn)100個(gè)血清樣品之后，柱效就下降50%。這兩種情況的差別之所以這么大，關(guān)鍵在于處理樣品的方法不同。

    如果柱效很快下降，應(yīng)考慮上節(jié)所提到的人為不利因素。N值突然下降（如一個(gè)工作日內(nèi)），應(yīng)考慮柱頭塌陷或進(jìn)了不合格的樣品。如果使用了不同系統(tǒng)的色譜柱造成柱效下降，是某系統(tǒng)中存在柱外效應(yīng)。新建立的方法中柱效下降，可能是樣品和其它內(nèi)在因素引起，此時(shí)要采取相應(yīng)措施，防止繼續(xù)給柱造成危害。

2、峰形變壞

    出現(xiàn)拖尾峰、分叉峰或非高斯峰的原因很多，但總是與塔板數(shù)驟然下降在一起的。峰形變壞而保留時(shí)間不變，多半是柱受到阻塞（不銹鋼燒結(jié)片），或者柱頭有了空穴。 

3、壓力增加

    和柱塔板數(shù)不斷減少一樣，在使用過(guò)程中柱壓慢慢增加，可視為正常。如果壓力一下子增加過(guò)高，應(yīng)考慮兩種可能，一是樣品沉積在柱內(nèi)，二是柱內(nèi)硬件阻塞（未考慮系統(tǒng)其它部分的阻塞）。

    對(duì)于*種情況，要用能溶解所用樣品的溶劑沖洗。沖洗時(shí)拆開柱與檢測(cè)器之間接頭，正向沖洗或?qū)⒅隹诮釉诒蒙戏聪驔_洗（如果柱條件許可），使用大約30～50mL溶劑。不要讓沖洗液通過(guò)檢測(cè)器流動(dòng)池，以防污染。在沖洗過(guò)程中不斷檢查，直到壓力恢復(fù)正常為止。如沖洗無(wú)效，應(yīng)該考慮是第二種情況，先換燒結(jié)不銹鋼過(guò)濾片，拆下柱，擰開柱頭上的壓帽，持垂直方向小心取出不銹鋼過(guò)濾片，換上新的（不是洗過(guò)的舊濾片）。換濾片時(shí)盡量不要攪動(dòng)柱頭填料，如有塌陷，可用同種填料中乙醇調(diào)成糊狀補(bǔ)平柱頭，壓緊，壓平，柱性能可恢復(fù)如前。如果柱頭填料己臟，可挖去2～3mm，用新填料補(bǔ)平。

4、保留時(shí)間的改變

    保留時(shí)間的變化指兩種類型的情況，*種是同一根柱樣品間的保留變化，第二種類型主要是填料的差異造成的，許多實(shí)驗(yàn)都會(huì)碰到，現(xiàn)討論如下。

    不同牌號(hào)的色譜柱分離的色譜峰保留時(shí)間可在小范圍內(nèi)移動(dòng)，但峰的順序和分辨率不變，可改變流速或溶劑強(qiáng)度（反相色譜加水調(diào)節(jié)）進(jìn)行校正。如果譜圖中色譜順序發(fā)生了變化，或者兩峰重疊在一起，問(wèn)題就比較嚴(yán)重。保留時(shí)間發(fā)生大的變化，主要由柱填料硅酸相互作用所致，另外有次級(jí)保留因素的影響。硅膠為基質(zhì)的填料表面含有硅醇，有的封尾填料可部分去掉硅醇、不封尾填料的硅膠表面硅醇基更多。酸性或堿性分子可與硅醇發(fā)生不同程度的相互作用。硅酸與樣品分子作用的強(qiáng)弱，因不同批號(hào)的硅膠和不鍵合相填料而異。即使同批號(hào)的硅膠而不同批號(hào)的鍵合相也有差異。硅醇對(duì)陽(yáng)離子或堿性樣品影響zui大。參照下列要求做可以減少色譜柱之間保留時(shí)間的變化。

    （1）僅用同一廠商的柱。實(shí)際上不具可操作性，但zui起碼作某一專門分析方法時(shí)要用同一廠商的柱。

    （2）設(shè)計(jì)分離條件，使保留值變化zui小（建立標(biāo)準(zhǔn)的方法）。

    （3）選用液相色譜系統(tǒng)或色譜柱對(duì)次級(jí)保留因素（外界）靈敏度zui低。

    （4）換新柱時(shí)調(diào)整分析條件保持舊柱的保留值（改變條件）。這一步工作是*的，在長(zhǎng)期的常規(guī)分析中，不會(huì)從頭至尾用一根柱，中間總要換新柱，每換一次，都應(yīng)仔細(xì)地調(diào)整各組分的保留。

    在實(shí)際工作中，應(yīng)考慮到可能會(huì)發(fā)生什么問(wèn)題，怎樣預(yù)防這些問(wèn)題的發(fā)生。

    *，前面提到的作某一專門分析盡量用同一批號(hào)的柱。也可與廠商接洽，提出特殊的要求。

    第二，選擇硅醇影響zui小的分離條件，減少柱間的差異。如在流動(dòng)相中添加三乙胺抑制硅醇的作用。

    第三，許多色譜工作者認(rèn)為，在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑更能抗硅醇的干擾，使保留具有更好的重復(fù)性。

    不管什么情況下引起保留值的明顯變化，都應(yīng)該改善分離條件。

    改善特別差的峰的分離度，并使保留值穩(wěn)定下來(lái)。例如用梯度洗脫分析體液中的氨基酸，這種復(fù)雜的樣品有20多個(gè)組分，保留稍有變化可能對(duì)分離就產(chǎn)生災(zāi)難性的結(jié)果。一些組分，如偏向酸性或堿性的組分很易發(fā)生保留值的改變，應(yīng)用不同流動(dòng)相的組成、pH值和緩沖液的濃度，可以改善關(guān)鍵色譜峰間的分離。色譜峰分離度變差，可能會(huì)系統(tǒng)地改變保留值。

    塔板數(shù)降低、壓力增高、峰形變差、保留值變化可能同時(shí)發(fā)生，可能都是由柱引起的。下表的內(nèi)容可幫助找到一些故障的原因，有些內(nèi)容將在后面的章節(jié)中詳細(xì)討論。

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