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嬰幼兒奶粉中雙氰胺的檢測(cè)方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）
北京時(shí)間1月25日凌晨消息，新西蘭牛奶中發(fā)現(xiàn)了有害物質(zhì)——雙氰胺。雙氰胺又名二氰二胺，縮寫DICY或DCD。雖然標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)食品中的雙氰胺*，但高劑量的雙氰胺對(duì)人體是有毒的。
針對(duì)嬰幼兒奶粉中基質(zhì)復(fù)雜的特點(diǎn)，本方法加大了凈化材料的用量，以獲得了更好的凈化效果。采用天津博納艾杰爾科技的新一代的Cleanert® MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管（500mg/15mL，貨號(hào)：MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色譜柱，建立了奶粉中雙氰胺的MAS-QuEChERS快速前處理方法和LC-UV以及LC-MS/MS檢測(cè)方法。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器、試劑與材料
液相色譜儀，渦旋振蕩器，超聲波清洗機(jī)，氮吹儀。
雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert® MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管，Venusil® HILIC液相色譜柱，微孔濾膜，乙酸銨、乙酸、乙腈為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
1.2 實(shí)驗(yàn)步驟
稱取1g試樣于50mL具塞離心管中，加2mL水，渦旋30s，加2ml乙腈渦旋30s。再往現(xiàn)有的提取液中加2mL乙腈，重復(fù)上述提取步驟。再將該提取步驟重復(fù)2次，得到共計(jì)約10mL的提取液。以4000r/min離心5min，將全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL），將MAS管上下晃動(dòng)30s，然后渦旋30s后，8000r/min離心5min，取全部上清液（約10ml）于玻璃試管中，50℃下氮?dú)獯蹈?，加?ml乙腈復(fù)溶，過0.22μm微孔濾膜，待測(cè)。
注：1.做基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)溶液建議選擇以水為溶劑，防止加標(biāo)瞬間發(fā)生蛋白沉淀；
2.乙腈提取分4次，為防止乙腈體積過多時(shí)沉淀蛋白速度過快，影響提取效果。
1.3 實(shí)驗(yàn)條件
1.3.1液相色譜法（HPLC法）：
色譜柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；
流動(dòng)相： 10mmol/L乙酸銨（pH=4.0）：乙腈=15: 85；
波長：220nm；進(jìn)樣量：10µl；柱溫：30℃；流速：0.8mL/min。
1.3.2 LC-MS/MS法：
（1）色譜條件：
色譜柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；
流動(dòng)相：A：0.5mmol/L乙酸銨（pH=4.0）
B：乙腈；
進(jìn)樣量：10µL；柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min。
| 時(shí)間，min | A% | B% |
| 0 | 10 | 90 |
| 0.4 | 50 | 50 |
| 1.8 | 50 | 50 |
| 1.9 | 10 | 90 |
| 7 | 10 | 90 |
（2）質(zhì)譜條件：
質(zhì)譜儀：API 4000+；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。
| 藥物名稱 | 監(jiān)測(cè)離子對(duì) | DP | EP | CE | CXP |
| 雙氰胺 | 85.1/68.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
| 85.1/43.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
2.結(jié)果與討論
2.1 液相色譜法：
2.1.1雙氰胺的液相色譜圖
2.1.2實(shí)際樣品基質(zhì)加標(biāo)的線性關(guān)系和檢出限
準(zhǔn)確稱取雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液；
分別稱取1g奶粉試樣，添加一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含雙氰胺為0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加樣品，按照上述提取、凈化方法操作，所得凈化液按照上述色譜條件，依次進(jìn)樣檢測(cè)。以雙氰胺含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，擬合線性方程，結(jié)果見表4：
| 名稱 | 保留時(shí)間 | 線性方程 | 相關(guān)系數(shù) | zui低定量限（S/N=10） |
| 雙氰胺 | 5.57min | Y=108.16X+27.827 | 0.9971 | 0.5µg/g |
2.1.3準(zhǔn)確度和精密度
選取市售某品牌嬰幼兒奶粉試樣，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5
| 平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均值 | RSD |
| 82.3% | 85.5% | 89.1% | 85.63% | 3.97% |
2.2 LC-MS/MS法
2.2.1雙氰胺的LC-MS/MS圖
2.2.2實(shí)際樣品基質(zhì)加標(biāo)的線性關(guān)系和檢出限
準(zhǔn)確稱取雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液；
分別稱取1g奶粉試樣，添加一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含雙氰胺為5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加樣品，按照上述提取、凈化方法操作，所得凈化液按照上述液質(zhì)條件，依次進(jìn)樣檢測(cè)。以雙氰胺含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，擬合線性方程，結(jié)果見表6：
| 名稱 | 保留時(shí)間 | 線性方程 | 相關(guān)系數(shù) | zui低定量限（S/N=10） |
| 雙氰胺 | 2.25min | Y=3859.1X+23694 | 0.9900 | 2ng/g |
2.2.3準(zhǔn)確度和精密度
選取市售某嬰幼兒奶粉試樣，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表7。采用空白樣品稀釋法判斷檢測(cè)方法的基質(zhì)效應(yīng)影響?？瞻變艋合♂尯鸵译嫦♂尩臉?biāo)準(zhǔn)溶液，雙氰胺峰面積和相對(duì)豐度比無明顯變化，故判斷該方法無基質(zhì)效應(yīng)的影響。
| 平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均值 | RSD |
| 82.5% | 83.5% | 89.3% | 85.2% | 4.31% |
相關(guān)方法：奶粉中雙氰胺的檢測(cè)方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）
| 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格型號(hào) | 貨號(hào) |
| 新一代 MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管（填料量加大，更適合嬰幼兒奶粉等復(fù)雜樣品） | 500mg/15mL，50支/包 | MS-SQA02 |
| MAS-QuChERS-雙氰胺凈化管 | 100mg/2mL，50支/包 | MS-SQA01 |
| Venusil HILIC液相色譜柱 | 4.6*250mm，5μm，100Å | VH952505-0 |
| 2.1*150mm，5μm，100Å | VH951502-0 | |
| Clarinert微孔濾膜 Nylon（通用） | 尼龍0.22μm，直徑50mm, 100/Pk | AM025020 |
| Clarinert 針式過濾器 Nylon（通用） | 尼龍0.22um， 直徑13mm，200/pk | AS021320 |
| 雙氰胺對(duì)照品 | 500mg /瓶，含量≥99.0% | DCD-0001 |
| 1g /瓶，含量≥99.0% | DCD-0002 | |
| 離心管 | 50mL，帶螺紋蓋，25個(gè)/包 | LXG0050 |
| 一次性注射器 | 5mL,100/pk | ZSQ-5ML |
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