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如何對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞不表達(dá)進(jìn)行補(bǔ)救
問(wèn)：
zui近做細(xì)胞轉(zhuǎn)染，預(yù)篩選穩(wěn)定克隆，載體為pEgfp-N1，pIERS
現(xiàn)在是平行做幾個(gè)基因，轉(zhuǎn)然后，只有空載體和一個(gè)基因可以看到綠色熒光，其余均沒(méi)有，這會(huì)是什么原因呢?怎么補(bǔ)救啊?
答：
需要考慮的問(wèn)題有：
1.你的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染的方法，是不是你的細(xì)胞本身就很難轉(zhuǎn)染，有些細(xì)胞用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染率很低的。在求助時(shí)告知細(xì)胞和具體的轉(zhuǎn)染方法和試劑。
2.質(zhì)粒的純度和質(zhì)量：看你使用那種試劑盒提取的，我們的經(jīng)驗(yàn)是使用Qiagen比國(guó)產(chǎn)的一些試劑盒差別很大。
3.pEGFP-N1可用來(lái)表達(dá)融合蛋白，如果你插入的目的基因帶終止密碼子的話(huà)，這時(shí)候如果轉(zhuǎn)讓率很低的話(huà)沒(méi)有綠色熒光，只有空載有綠色熒光，但是在轉(zhuǎn)染293T時(shí)我們發(fā)現(xiàn)帶終止密碼子的載體還可以見(jiàn)到熒光，但比空載明顯弱許多，不像空載體一樣所有的細(xì)胞都帶GPF。所以，不知你克隆時(shí)目的基因是否帶有終止密碼，如果去掉終止密碼子也要注意是否發(fā)生移碼錯(cuò)位。
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