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ELISA檢測試劑盒原理
應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中待測物質(zhì)水平。用純化的待測物質(zhì)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入待測物質(zhì),再與HRP標記的待測物質(zhì)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測物質(zhì)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中待測物質(zhì)濃度。
不同廠家的試劑盒的檢測范圍并不相同,一般說來,診斷試劑的檢測范圍以ng/ml計。而常見的科研試劑盒中的樣本中的目標蛋白,范圍可隨樣本的類型而變化。所以實驗前應(yīng)通過文獻和預(yù)實驗的方法確定樣本是否在所購試劑盒的范圍內(nèi),如果不在檢測范圍內(nèi),分兩種情況對待。
1. 如果樣本中目標蛋白太低,需找相應(yīng)靈敏度更高的試劑盒來檢測或濃縮樣本;
2. 如果樣本中目標蛋白太高,則需要進一步稀釋后進行檢測。
1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定用于IgG定量測定的文章,使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術(shù)發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的測定方法。
組織勻漿液的樣本,要制備過程中需要在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,防止蛋白成份被內(nèi)源性蛋白酶降解,造成檢測結(jié)果的值偏低。因組織勻漿液的樣本蛋白種類多,含量豐富,實驗參照血清血漿標本的處理方法進行,否則就會影響實驗結(jié)果。具體是加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標本,需稀釋時,請將樣本與樣本分析緩沖液等量加入,不足部分用標準品稀釋液補充至100ul。
因為目標蛋白不同,可能造成降解的蛋白類型可能不一樣,如果實驗前通過文獻確定用哪種蛋白酶抑制劑,有針對性加入,可節(jié)省抑制劑。如果查不到相關(guān)文獻,可采用組合抑制的辦法確保蛋白不易被降解。
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