實(shí)驗(yàn)原理

層析法是一種物理分離方法。柱層析法是層析方法中的一個(gè)類型，分為吸附柱層析法和分配柱層析法。本實(shí)驗(yàn)僅介紹吸附柱層析法。

吸附柱層析法是分離、純化和鑒定有機(jī)物的重要方法。它是根據(jù)混合物中各組分的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)（極性）來選擇合適的吸附劑和洗脫劑，從而利用吸附劑對(duì)各組分吸附能力的不同及各組分在洗脫劑中的溶解性能不同達(dá)到分離目的。吸附柱層析法通常是在玻璃層析柱中裝入表面積很大、經(jīng)過活化的多孔性或粉狀固體吸附劑（常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠等）。當(dāng)混合物溶液流過吸附柱時(shí)，各組分同時(shí)被吸附在柱的上端，然后從柱頂不斷加入溶劑（洗脫劑）洗脫。由于不同化合物吸附能力不同，從而隨著溶劑下移的速度不同，于是混合物中各組分按吸附劑對(duì)它們所吸附的強(qiáng)弱順序在柱中自上而下形成了若干色帶。                     

在洗脫過程中，柱中連續(xù)不斷地發(fā)生吸附和溶解的交替現(xiàn)象。被吸附的組分被溶解吸出來，隨著溶劑向下移動(dòng)，又遇到新的吸附劑顆粒，把組分從溶液中吸附出來，而繼續(xù)流下的新溶劑又使組分溶解而向下移動(dòng)，這樣經(jīng)過適當(dāng)時(shí)間移動(dòng)后，各種組分就可以*分開，繼續(xù)用溶劑洗脫，吸附能力zui弱的組分隨溶劑首先流出，再繼續(xù)加溶劑直至各組分依次全部由柱中洗出為止，分別收集各組分。

綠色植物如菠菜葉中的葉綠體含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素和葉黃素）兩大類天然色素。這兩類色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑提取。

葉綠素存在兩種結(jié)構(gòu)相似的形式即葉綠素a(C₅₅H₇₂O₅N₄Mg)和葉綠素b(C₅₅H₇₀O₆N₄Mg)，其差別僅是葉綠素a中一個(gè)甲基被甲?；〈鷱亩纬闪巳~綠素b。它們都是吡咯衍生物與金屬鎂的絡(luò)合物，是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素a 的含量通常是b 的3 倍。盡管葉綠素分子中含有一些極性基團(tuán)，但大的烴基結(jié)構(gòu)使它易溶于醚、石油醚等一些非極性的溶劑。

胡蘿卜素（C₄₀H₅₆）是具有長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的共軛多烯。它有三種異構(gòu)體，即a-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素含量zui多，也zui重要。在生物體內(nèi)，β-胡蘿卜素受酶催化氧化形成維生素A。目前β-胡蘿卜素已可進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，可作為維生素A 使用，也可作為食品工業(yè)中的色素。

葉黃素（C₄₀H₅₆O₂）是胡蘿卜素的羥基衍生物，它在綠葉中的含量通常是胡蘿卜素的兩倍。與胡蘿卜素相比，葉黃素較易溶于醇而在石油醚中溶解度較小。

石油醚是一種脂溶性很強(qiáng)的有機(jī)溶劑。葉綠體中的四種色素在石油醚中的溶解度是不同的：溶解度高的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得快；溶解度低的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得慢。溶解度zui高的是胡蘿卜素，它隨石油醚在濾紙上擴(kuò)散得zui快，葉黃素和葉綠素a的溶解度次之；葉綠素b的溶解度zui低，擴(kuò)散得zui慢。這樣，四種色素就在擴(kuò)散過程中分離開來。

同樣，提取液可用色層分析的原理加以分離。因吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿?dòng)時(shí)，混合物中各成分在兩相（流動(dòng)相和固定相）間具有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動(dòng)速度不同，經(jīng)過一定時(shí)間層析后，便將混合色素分離。

本實(shí)驗(yàn)是用活性氧化鋁作吸附劑，分離菠菜中胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。

實(shí)驗(yàn)試劑

1. 硅膠 G

2. 中性氧化鋁

3. 甲醇

4. 石油醚（ 60-90 ℃）

5. 丙酮

6. 乙酸乙酯

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 研缽

2. 布氏漏斗

3. 圓底燒瓶

4. 直形冷凝管

5. 色譜柱

6. 抽濾瓶

7. 燒杯

8. 鐵架臺(tái)

9. 脫脂棉723分光光度計(jì)

實(shí)驗(yàn)材料

菠菜葉

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 菠菜色素的提取

取2g 新鮮菠菜葉，與10mL 甲醇拌勻研磨5 分鐘，棄去濾液。殘?jiān)?0mL 的石油醚-甲醇（3:2）混合液進(jìn)行提取，共提取兩次。合并液用水洗后棄去甲醇層，石油醚層進(jìn)行干燥、濃縮。

2. 薄層層析

將上述的濃縮液點(diǎn)在硅膠G 的預(yù)制板上，分別用石油醚-丙酮（8:2）和石油醚-乙酸乙酯（6:4）兩種溶劑系統(tǒng)展開，經(jīng)過顯色后，進(jìn)行觀察并計(jì)算比移值。

3. 柱層析

取3g 中性氧化鋁進(jìn)行濕法裝柱。填料裝好后，從柱頂加入上述濃縮液，用石油醚-丙酮（9:1）、石油醚-丙酮（7:3）和正丁醇-乙醇-水（3:1:1）進(jìn)行洗脫，依次接收個(gè)色素帶，即得胡蘿卜素（橙黃色溶液）、葉黃素（黃色溶液）、葉綠素a（藍(lán)綠色溶液）以及葉綠素b（黃綠色溶液）。

稱取12g堿性三氧化二鋁加入30mL石油醚攪拌，浸泡10min。在層析柱內(nèi)加入一團(tuán)棉花（棉花要盡量?。┰诘撞吭偌尤?.5cm的石英砂，然后用石油醚半充滿柱子，再將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內(nèi)，倒時(shí)應(yīng)該緩慢，重復(fù)使用下面的石油醚，直到裝完。用石油醚洗柱內(nèi)壁，頂部加一小團(tuán)棉花，然后再加入石英砂0.5cm高。

樣品的分離層析

將濃縮液小心地從柱頂部加入。加完后打開活塞，讓液面下降到柱中砂層，關(guān)閉活塞，加幾滴石油醚沖洗內(nèi)壁，打開活塞，使液面下降如前，在柱頂小心加入約1.5—2cm高度的石油醚-丙酮洗脫劑，層析即開始進(jìn)行。

當(dāng)*個(gè)有色成分即將滴出時(shí)，另取一潔凈的燒杯收集，得黃色溶液，即胡蘿卜素。將洗脫劑換成1：7的石油醚-丙酮混合液，繼續(xù)洗脫可得到第二色帶的黃綠色溶液，即葉綠素a和葉黃素。

注意事項(xiàng)

1. 選材時(shí)要注意選取新鮮、顏色深的葉片。

2. 用丙酮和層析液都是易揮發(fā)且有一定毒性的有機(jī)溶劑，所以研磨時(shí)要快，收集的濾液要用棉塞塞住，層析時(shí)要加蓋，減少有機(jī)溶劑的揮發(fā)。

3. 在研磨時(shí)加入少許SiO₂，目的是為了研磨得充分；加入少許CaCO₃的目的是為了防止研磨時(shí)葉綠體中色素受到破壞；加入丙酮的目的是作為葉綠體中色素的溶劑。

4. 研磨過程中丙酮要少量多次加入，以免研磨時(shí)四處飛濺。

5. 過濾時(shí)不要使用濾紙而使用棉花，棉花塞在漏斗基部要松緊適當(dāng)。

6. 葉綠素要避光保存。葉黃素易溶于醇而在石油醚中溶解度較小，從嫩綠菠菜得到的提取液中，葉黃素含量很少，柱色譜中不易分出黃色帶。  

7. 萃取時(shí)不要?jiǎng)×艺袷?，以防止發(fā)生乳化現(xiàn)象。

8. 為了保持柱子的均一性，使整個(gè)吸附劑浸泡在溶劑或溶液中是必要的，否則當(dāng)柱中溶劑或溶液流干時(shí)，就會(huì)使柱身干裂，影響滲透和顯色的均一性。因此要保證整個(gè)裝樣過程中溶劑要高于三氧化二鋁的表面。

9. 在吸附劑上端加入脫脂棉（或?yàn)V紙）是使加樣品時(shí)不致把吸附劑沖起；在吸附柱下端加脫脂棉（或沙子）可以防止吸附劑細(xì)粒流出。

10. 層析柱填裝緊密與否，對(duì)分離效果很有影響，若各部分松緊不勻，會(huì)影響滲透速度和顯色的均勻。

11. 注意洗脫劑的配比，胡蘿卜素出來后，換成1：7的洗脫液。

12. 洗脫流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠，色素分離不開；也不要過慢，使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過程中，凝膠床高度下降，色素洗脫很慢。因此應(yīng)控制洗脫流速，以每分鐘60~80滴為宜。

13. 樣品一定要足夠濃縮，加樣量不要過大或過小。