隨著去除核糖體測(cè)序技術(shù)深入發(fā)展，越來(lái)越多的環(huán)狀RNA（circRNA）不斷報(bào)道發(fā)現(xiàn)，基于生物信息學(xué)分析顯示circRNA發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能。然后如何采用實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)一步驗(yàn)證circRNA的生物學(xué)功能顯得尤為重要，本文帶大家一起探討circRNA功能驗(yàn)證策略。

1. circRNA定量驗(yàn)證

circRNA定量驗(yàn)證手段與常規(guī)PCR手段不同，常規(guī)手段是圍繞目的片段的上下游分別設(shè)計(jì)PCR引物，稱(chēng)之為convergent primer，需擴(kuò)增的片段位于上下游引物之間（如圖1.1）。而對(duì)于circRNA，尤其外顯子環(huán)化circRNA，除backsplice junction位點(diǎn)處不同于linear RNA之外，body區(qū)與linearRNA是一致的。因此，驗(yàn)證時(shí)需要特異性針對(duì)backsplice junction位點(diǎn)處設(shè)計(jì)primer，稱(chēng)之為divergent primer（如圖1.1），而且設(shè)計(jì)的PCR product的長(zhǎng)度越短越好，可以增強(qiáng)backsplice junction位點(diǎn)處擴(kuò)增效率。

圖1.1 convergent primer vs divergent primer

為增強(qiáng)circRNA的驗(yàn)證效率，起始模版需滿(mǎn)足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。

驗(yàn)證策略：對(duì)3free RNA以及genome DNA同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)PCR product大小（如圖1.2）。

圖1.2 circRNA引物擴(kuò)增結(jié)果

2. circRNA Northern blot驗(yàn)證

Northern blot方法是一種比較古老但行之有效的序列驗(yàn)證方法，需圍繞circRNA設(shè)計(jì)探針序列，而探針序列設(shè)計(jì)是驗(yàn)證成功至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。對(duì)于circRNA探針設(shè)計(jì)，我們建議以下兩點(diǎn)：1. 對(duì)于外顯子環(huán)化circRNA，建議探針盡可能跨backsplice junction位點(diǎn)；2.對(duì)內(nèi)含子環(huán)化circRNA，可圍繞內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)探針。

驗(yàn)證策略：對(duì)3 free RNA、total RNA以及genome DNA同時(shí)進(jìn)行雜交驗(yàn)證。

3. circRNA過(guò)表達(dá)

circRNA過(guò)表達(dá)思想主要源于circRNA生物形成機(jī)制，已有多篇文章報(bào)道circRNA成環(huán)機(jī)制，目前比較*的成環(huán)機(jī)制為circRNA側(cè)翼序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)，稱(chēng)之為Alu結(jié)構(gòu)（如圖2）。

圖2 circRNA側(cè)翼結(jié)構(gòu)特征

基于circRNA側(cè)翼Alu序列特征，PCR擴(kuò)增含側(cè)翼Alu序列的目標(biāo)DNA序列，隨后依據(jù)對(duì)應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切，進(jìn)而連接pEGFP-C1載體。連接載體進(jìn)而轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)細(xì)胞樣本，定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率?；赿ivergent primer驗(yàn)證circRNA過(guò)表達(dá)倍數(shù)。

過(guò)表達(dá)策略：1. 擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域包含circRNA側(cè)翼Alu序列或內(nèi)部堿基互補(bǔ)序列，側(cè)翼上下游1kb處過(guò)表達(dá)效率更佳；2. 目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增基于基因組DNA為模版。

4. circRNA敲除

circRNA敲除思路主要針對(duì)circRNA backsplice junction處序列信息設(shè)計(jì)siRNA，對(duì)于內(nèi)含子環(huán)化circRNA，也可針對(duì)內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)siRNA進(jìn)行干擾。Divergent primer驗(yàn)證circRNA敲除倍數(shù)。

敲除策略：

1. 外顯子環(huán)化circRNA，針對(duì)backsplice junction位點(diǎn)前后序列設(shè)計(jì)siRNA，如圖3所示；

2. 內(nèi)含子環(huán)化circRNA，除針對(duì)backsplice junction位點(diǎn)前后序列設(shè)計(jì)siRNA序列以外，也可針對(duì)內(nèi)含子區(qū)域序列設(shè)計(jì)siRNA。

3. 每個(gè)siRNA設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的對(duì)照，backsplice junction位點(diǎn)一端互補(bǔ)配對(duì)，另一端錯(cuò)配，如圖3所示。

圖3 基于siRNA敲除策略

參考文獻(xiàn)

1. New Phytologist (2015) doi: 10.1111/nph.13585.
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4. Cell Reports (2015) 10, 170–177.

來(lái)源:聯(lián)川生物技術(shù)公司