1　主題內(nèi)容與適用范圍

本方法規(guī)定了壓力蒸汽滅菌技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及其評價(jià)滅菌效果的檢測方法

　　本方法適用于對壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的評價(jià)。

2　試劑

　　本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未說明規(guī)格者，均為分析純(AR)，水為蒸餾水。

2.1蛋白胨。

2.2葡萄糖。

2.3溴甲酚紫酒精溶液：取溴甲酚紫2.0g，溶于100mL95%乙醇中。

2.4溴甲酚紫蛋白胨水培養(yǎng)基配制：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)pH值7.0～7.2，然后再加2%溴甲酚紫酒精溶液0.6mL，搖勻后，按5mL/管，分裝包口，置壓力蒸汽滅菌器中，于115℃滅菌40min后備用。

3　指示菌

嗜熱脂肪桿菌芽胞(ATCC 7953或SSI K31)菌片，含菌量為5×105～5×106cfu/片，121℃下，殺滅90%微生物所需時(shí)間D121值為1.3～1.9min，殺滅時(shí)間(KT值)為≤19min，存活時(shí)間(ST值)為≥3.9min。

4　化學(xué)指示劑

需用衛(wèi)生部批準(zhǔn)的化學(xué)指示劑。

5　技術(shù)要求

6　檢測方法

6.1  生物學(xué)指標(biāo)(用作壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的依據(jù))。

6.1.1  將嗜熱脂肪桿菌芽胞菌片兩個分別放入滅菌小紙袋內(nèi)，置于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包中心部位。

6.1.2  滅菌柜室內(nèi)，上、中層*和排氣口處各放置一個標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包(由3件平紋長袖手術(shù)衣，4塊小手術(shù)巾，2塊中手術(shù)巾，1塊大手術(shù)巾，30塊10cm×10cm、8層紗布敷料包裹成25cm×30cm×30cm大小)。手提壓力蒸汽滅菌器用通氣貯物盒(22cm×13cm×6cm)代替標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包，盒內(nèi)盛滿中試管，指示菌片放于中心部位兩只滅菌試管內(nèi)(試管口用滅菌牛皮紙包封)，將盒平放于手提壓力蒸汽滅菌器底部。

6.1.3  經(jīng)一個滅菌周期后，在無菌條件下，取出標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包或通氣貯物盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，56℃培養(yǎng)48h，觀察培養(yǎng)基顏色變化。

6.2化學(xué)指標(biāo)

在物品包外用化學(xué)指示膠帶，可作為物品是否經(jīng)過滅菌的處理標(biāo)志。在物品包內(nèi)中心部位用化學(xué)指示劑，可作為物品是否滅菌的參考標(biāo)志。

7　結(jié)果判定及評價(jià)

7.1  同次檢測中，標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包或通氣貯物盒內(nèi)，每個指示菌片接種的溴甲酚紫蛋白胨水培養(yǎng)基全部不變色，判定為滅菌合格。指示菌片之一接種的溴甲酚紫蛋白胨水培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色時(shí)，判定為滅菌不合格。

7.2  化學(xué)指示劑的顏色變?yōu)榕c滅菌合格標(biāo)準(zhǔn)色相同時(shí)，或熔化時(shí)作為滅菌合格的參考標(biāo)準(zhǔn)。

　　第二篇　紫外線表面消毒效果評價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)

8　主題內(nèi)容與適用范圍

本方法規(guī)定了物體表面消毒用紫外線的波長、強(qiáng)度及評價(jià)其消毒效果的物理學(xué)指標(biāo)和生物學(xué)檢測方法。

　　本方法適用于紫外線直接照射到的物體表面消毒效果評價(jià)。

9　指示菌

9.1  大腸桿菌(8099或ATCC 25922)。

9.2  枯草桿菌黑色變種芽胞(ATCC 9372)。

10　物理學(xué)指標(biāo)

10.1  在電壓220V時(shí)，普通30W直管型紫外線燈，在室溫為20～25℃的使用情況下，253.7nm紫外線輻射強(qiáng)度(垂直1m處)應(yīng)≥70μW/ cm2。

10.2  在電壓220V時(shí)，高強(qiáng)度紫外線燈，在室溫為20～25C的使用情況下，253.7nm紫外線輻射強(qiáng)度(垂直1m處)應(yīng)≥200μW/ cm2。

10.3  照射劑量按式(1)計(jì)算：

　　劑量(μW·s/cm2)＝強(qiáng)度(μW/cm2)×時(shí)間(s)………………………(1)

11　檢測方法

11.1  物理學(xué)檢測方法

11.1.1  燈管的紫外線強(qiáng)度(μW/cm2)用中心波長為253.7nm的紫外線強(qiáng)度測定儀(標(biāo)定有效期內(nèi))，在燈管垂直位置1m處測定。

11.1.2  在實(shí)際應(yīng)用中消毒表面的照射強(qiáng)度應(yīng)以燈管與消毒對象的實(shí)際距離測定。

11.1.3  表面消毒接受的照射劑量，應(yīng)達(dá)殺滅目標(biāo)微生物所需。對大腸桿菌，照射劑量應(yīng)達(dá)到20000μW·s/cm2，對枯草桿菌黑色變種芽胞應(yīng)達(dá)到100000μW·s/ cm2。

11.2  生物學(xué)檢測方法

11.2.1  采用載體定量消毒試驗(yàn)。載體制備按本標(biāo)準(zhǔn)附錄C進(jìn)行。

11.2.2  開啟紫外線燈5min后，將8個染菌玻片平放于滅菌器皿中，水平放于適當(dāng)距離照射，于4個不同間隔時(shí)間各取出2個染菌玻片，分別投入2個盛有5mL洗脫液(1%吐溫80，1%蛋白胨生理鹽水)試管中，振打80次。

11.2.3  經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取0.5mL洗脫液，作平板傾注，每個染菌玻片接種兩個，放37℃培養(yǎng)48h作活菌計(jì)數(shù)。

11.2.4  陽性對照，除不作照射處理外，取2個染菌玻片分別投入2個盛有5mL洗脫液中振打80次，余按4.2.3進(jìn)行。

11.2.5  計(jì)算殺滅率

                陽性對照回收菌數(shù) – 試驗(yàn)組回收菌數(shù)

殺滅率（%）=                                     ×100······（2） 

                        陽性對照回收菌數(shù)

12　判定標(biāo)準(zhǔn)

12.1  對指示菌殺滅率≥99.9%判為消毒合格。

12.2達(dá)物理學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，作為消毒合格的參考標(biāo)準(zhǔn)。

　　第三篇　液體消毒劑消毒效果評價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)

13　主題內(nèi)容與適用范圍

本方法具體規(guī)定了消毒劑消毒效果生物學(xué)檢測方法及其評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

　　本方法適用于消毒劑對各種物體的消毒效果評價(jià)。

14　理化指標(biāo)

    置20±2℃水浴中，測定在使用濃度下殺滅指示微生物達(dá)到消毒或滅菌所需的短時(shí)間(min)。

15　指示微生物

15.1  細(xì)菌

15.1.1  細(xì)菌繁殖體：金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸桿菌(8099或ATCC 25922)。

15.1.2  細(xì)菌芽胞：枯草桿菌黑色變種芽胞(ATCC 9732)。

15.2  真菌：白色念珠菌(ATCC 10231)。

15.3  乙型肝炎表面抗原：純化抗原(1.0mg/mL)。

16　檢測方法

16.1  中和試驗(yàn)(見附錄 A)。

16.2消毒劑定性消毒試驗(yàn)(見附錄 B)。

16.3消毒劑定量消毒試驗(yàn)(見附錄 C)。

16.4消毒劑殺菌能量試驗(yàn)(見附錄 D)。

16.5乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗原性破壞試驗(yàn)(見附錄 E)。

17　消毒效果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

17.1  對細(xì)菌和真菌的殺滅率≥99.9%，對HBsAg，將檢測方法靈敏度104倍或5×104倍(載體試驗(yàn))的HBsAg抗原性破壞，可判為消毒合格。

17.2  對枯草桿菌黑色變種芽胞全部殺滅，可判為滅菌合格。

17.3  在實(shí)際應(yīng)用中消毒效果評價(jià)以有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)的低濃度和短時(shí)間為該消毒劑達(dá)到實(shí)用消毒所需的濃度和時(shí)間。

附錄A

中和劑中和效果試驗(yàn)

(補(bǔ)充件)

A1  內(nèi)容提要

　　為了準(zhǔn)確評價(jià)消毒劑對微生物的殺滅作用，消毒試驗(yàn)中要求選擇適當(dāng)中和劑。所選中和劑不僅能及時(shí)中止消毒劑的殺微生物作用，且中和劑本身及其與消毒劑的反應(yīng)產(chǎn)物(下稱中和產(chǎn)物)尚需對微生物無抑制或殺滅作用，對培養(yǎng)基無不良影響。

A2  培養(yǎng)基和試劑

A2.1  營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

成分：

  蛋白胨                            10g

  牛肉膏                             3g

  氯化鈉                             5g

  瓊脂                              15g-20g

  蒸餾水                            1000mL

制法：除瓊脂外，其他成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH7.2-7.4，加入瓊脂后加熱溶解，過濾分裝，經(jīng)121℃、壓力蒸汽作用30min，滅菌后備用。

A2.2  0.03mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.6，下稱PBS)。

成分：磷酸氫二鈉　　                   2.84g

磷酸二氫鉀                       1.36g

蒸餾水                          1000.00mL

　　制法：將磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀溶解于蒸餾水中，pH為7.2～7.4，分裝，經(jīng)121℃、30min壓力蒸汽滅菌后備用。

A3  器材

A3.1  錐形燒瓶。

A3.2  平皿(直徑9cm)。

A3.3  量筒。

A3.4  精密pH試紙。

A3.5  無菌試管。

A3.6  無菌刻度吸管(1.0，5.0，10.0mL)。

A3.7  恒溫培養(yǎng)箱。

A3.8  冰箱。

A3.9  菌落計(jì)數(shù)器。

A3.10  酒精燈。

A4  中和劑(注明生產(chǎn)廠家，批號)

A5  操作方法

A5.1  用PBS將指示菌制成5×105～5×106cfu/mL懸液。

A5.2  將消毒劑用滅菌蒸餾水配制成3種不同濃度，在不加中和劑的情況下，測知該消毒劑10min抑殺指示菌99.9%以上的低有效濃度。

A5.3  取消毒劑10min抑殺指示菌的低有效濃度與待選擇中和劑進(jìn)行試驗(yàn)，選出中和劑種類并依據(jù)等當(dāng)量中和原則，調(diào)整中和劑濃度，選出試驗(yàn)濃度的消毒劑使用中和劑的濃度。

A5.4  中和劑選擇試驗(yàn)時(shí)，先將消毒劑1.0mL與中和劑溶液9.0mL混合，制成中和產(chǎn)物溶液，再按表A1分組進(jìn)行。

表A1中和劑選擇試驗(yàn)

    然后，傾注平板置37℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，按稀釋倍數(shù)計(jì)算出回收菌數(shù)（cfu/mL）。

A6  中和試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告方法(如表A2)

表A2中和試驗(yàn)結(jié)果舉例

　3、4、5組間誤差率計(jì)算公式

誤差率（%）=[（∣三組均數(shù)-3組菌數(shù)∣+∣三組均數(shù)-4組菌數(shù)∣+∣三組均數(shù)-5組菌數(shù)∣）/ （3×三組均數(shù)）]×100

A7  判定標(biāo)準(zhǔn)

A7.1  3、4、5組菌數(shù)相似，其誤差率≤10%。

A7.2  6組無菌生長。

A7.3  2組菌數(shù)明顯少于3、4、5組。

A7.4  1組不長菌或明顯少于2組。

　　符合上述標(biāo)準(zhǔn)的中和劑表明可消除消毒劑對指示菌的作用，中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對指示菌無毒害，判定為該消毒劑的中和劑。

A8  消毒試驗(yàn)用中和劑濃度的選擇

按A5.4步驟進(jìn)行，按A7.1～7.4的標(biāo)準(zhǔn)判定。

附錄B

消毒劑定性消毒試驗(yàn)

(補(bǔ)充件)

B1  內(nèi)容提要

定性消毒試驗(yàn)是測定受消毒因子作用后的樣本有無細(xì)菌生長的試驗(yàn)方法。用于對消毒因子滅菌效果的鑒定和消毒劑殺滅細(xì)菌效果的初步評價(jià)。

B2  培養(yǎng)基與試劑

B2.1  普通肉湯培養(yǎng)基

B2.1.1  成分：蛋白胨　　　                10.00g

氯化鈉　　　　　　　　　　　 5.00g

肉浸液　　　　　　　　　 1000.00mL

B2.1.2  制法：取蛋白胨、氯化鈉加入肉浸液內(nèi)，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH弱堿性，煮沸、濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.2～7.4，壓力蒸汽滅菌備用。

B2.2  試劑

B2.2.1  稀釋液：含1%蛋白胨的0.03mol/L PBS(pH7.2～7.4)。

B2.2.2  滅菌蒸餾水。

B2.2.3  中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A選擇。

B3器材

B3.1  滅菌刻度吸管(1.0，5.0，10.0mL)。

B3.2  滅菌試管。

B3.3  滅菌三角燒瓶。

B3.4  酒精燈。

B3.5  恒溫水浴箱。

B3.6  恒溫培養(yǎng)箱。

B4  試驗(yàn)方法

B4.1  將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用稀釋液配制成含菌量為5×105～5×106cfu/mL的菌懸液。

B4.2  將滅菌試管10支排列于試管架上，標(biāo)記管號。

B4.3  每個試管加滅菌蒸餾水2.5mL，放20±2℃水浴中。

B4.4  于第1管內(nèi)加適當(dāng)濃度消毒液2.5mL，混勻后取2.5mL移入第2管，再次混勻，從第2管中取2.5mL移入第3管，以此類推第9管，混勻后棄去2.5mL，第10管中不加消毒液作對照。

B4.5  加菌懸液2.5mL于各管中，混勻并記錄各管加菌時(shí)間，使菌藥混合液中含菌量均為105～106cfu/mL。

B4.6  各管分別于加菌后4個不同間隔時(shí)間，取出0.5mL，加入4.5mL中和劑內(nèi)，中和10min后，取出0.5mL加入4.5mL營養(yǎng)肉湯管內(nèi)。

B4.7  將接種細(xì)菌的肉湯管放37℃培養(yǎng)48h，觀察初步結(jié)果，無菌生長管繼續(xù)培養(yǎng)第7天。

B4.8  試驗(yàn)重復(fù)5次。

B5  結(jié)果判定

B5.1  若肉湯管混濁，則表示有菌生長，記為陽性，以(+)表示。

B5.2  若培養(yǎng)第7天，肉湯管澄清，則表示無菌生長，記為陰性，以(—)表示。

B5.3  對難以判定的肉湯管，取0.1mL接種于營養(yǎng)瓊脂平板，用滅菌L棒涂勻，放37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)；并做涂片染色鏡檢，判斷是否有指示菌生長。有指示菌生長記為陽性。

B5.4  5次試驗(yàn)，均無指示菌生長表示達(dá)到滅菌。

附錄C

消毒劑定量消毒試驗(yàn)

(補(bǔ)充件)

C1內(nèi)容提要

　　定量消毒試驗(yàn)是測定受消毒因子作用后，樣本殘存微生物數(shù)量的試驗(yàn)方法，以殺滅率表示結(jié)果。用于對消毒劑殺滅效果的評價(jià)。

C2  培養(yǎng)基與試劑

C2.1  普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按本標(biāo)準(zhǔn)A2.1制備。

C2.2  試劑

C2.2.1  稀釋液：含1%蛋白胨的0.03mol/L PBS(pH7.2～7.4)。

C2.2.2  滅菌蒸餾水。

C2.2.3  中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A選擇。

C2.2.4  0.03mol/L PBS(pH7.2～7.4)。

C2.2.5  洗脫液：含中和劑、1%蛋白胨、0.1%吐溫80的PBS。

C3  器材

C3.1  滅菌刻度吸管(1.0，5.0，10.0mL)。

C3.2  滅菌試管。

C3.3  滅菌三角燒瓶。

C3.4  滅菌平皿(直徑為9cm)。

C3.5  恒溫水浴箱。

C3.6  恒溫培養(yǎng)箱。

C3.7  酒精燈。

C3.8  菌落計(jì)數(shù)器。

C3.9  微量進(jìn)樣器。

C3.10  載體：根據(jù)需要及試驗(yàn)?zāi)康倪x用經(jīng)脫脂處理0.5cm×1.0cm大小的布片、紙片、玻片、橡膠片、塑料片、不銹鋼片或鋁片。

C4  試驗(yàn)方法

C4.1  定量懸液試驗(yàn)

C4.1.1  將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用稀釋液稀釋成含菌量為5×105～5×106cfu/mL的菌懸液。

C4.1.2  將消毒劑用滅菌蒸餾水稀釋成3個不同濃度，各吸取4.5mL分別加入三個試管內(nèi)，放20±2℃水浴中。

C4.1.3  待試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，在三個試管中分別加入0.5mL菌懸液(含菌量為5×105～5×106cfu/mL)，混勻并開始記時(shí)。

C4.1.4  分別于4個不同間隔時(shí)間，各取0.5mL菌液混合液移入4.5mL中和劑中混勻。

C4.1.5  中和10min，作適當(dāng)稀釋后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

C4.1.6  陽性對照以洗脫液代替消毒液，同時(shí)按C4.1.2～C4.1.5進(jìn)行。

C4.1.7  按不同稀釋度推算出每個樣本存活菌數(shù)(cfu/mL)，按式(C1)計(jì)算殺滅率：

C4.1.8  試驗(yàn)重復(fù)5次。

C4.2  載體定量試驗(yàn)

C4.2.1  將滅菌載體平放于滅菌平皿內(nèi)，每個載體滴注定量菌液(載體回收菌量達(dá)5×105～5×106cfu/片)，涂勻，放37℃培養(yǎng)箱待干。應(yīng)用市售染菌載體時(shí)，回收菌量亦應(yīng)達(dá)5×105～5×106cfu/片)。

C4.2.2  用滅菌蒸餾水將消毒劑稀釋成3個不同濃度，各吸取5mL分別加入三個試管內(nèi)，放20±2℃水浴中。

C4.2.3  待試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，加入染菌載體，作用規(guī)定時(shí)間，將染菌載體移入含中和劑的5mL洗脫液試管內(nèi)，中和10min，振打80次，適當(dāng)稀釋，接種兩個平板。放37℃培養(yǎng)24～48h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

C4.2.4  陽性對照，以洗脫液代替消毒液按C4.2.2～C4.2.3進(jìn)行。

C5  結(jié)果判定

C5.1  5次試驗(yàn)的殺滅率均≥99.9%判為消毒合格。

C5.2  對枯草桿菌黑色變種芽胞5次試驗(yàn)均全部殺滅判為消毒合格。

附錄D

有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)

(補(bǔ)充件)

D1  內(nèi)容提要

　　有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)是測定消毒劑對有機(jī)物保護(hù)條件下的微生物的殺滅作用，以殺滅率表示之，其結(jié)果與該消毒劑定量消毒試驗(yàn)相比較，用于評價(jià)有機(jī)物對消毒劑的殺菌能力的影響。

D2  培養(yǎng)基與試劑

D2.1  普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按本標(biāo)準(zhǔn)A2.1制備。

D2.2  試劑：

D2.2.1  稀釋液：同C2.2.1。

D2.2.2  滅菌蒸餾水。

D2.2.3  中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A進(jìn)行選擇。

D2.2.4  0.03mol/L磷酸緩沖液(pH7.2～7.4)(簡稱PBS)。

D2.2.5  洗脫液：含1%蛋白胨，0.1%吐溫80的生理鹽水。

D2.2.6  小牛血清加入菌懸液中，使其終濃度為10%。

D3  器材

　　同本標(biāo)準(zhǔn)C3。

D4試驗(yàn)方法

D4.1  實(shí)驗(yàn)前預(yù)先將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，用稀釋液稀釋，加入小牛血清，使其終含血清量為10%，含菌數(shù)為5×105～5×106cfu/mL，以此作為試驗(yàn)菌懸液。

D4.2  以下步驟同本標(biāo)準(zhǔn)C4.1.2～C4.1.8。

D5  結(jié)果判定

D5.1  5次試驗(yàn)的殺滅率均大于99.9%所需低濃度和短時(shí)間，判為該消毒劑在有機(jī)物存在下，可以達(dá)到消毒的有效濃度和時(shí)間。

D5.2  此有效濃度和時(shí)間與定量消毒試驗(yàn)達(dá)到消毒的有效濃度和時(shí)間相同或相近，判為有機(jī)物對消毒劑殺菌作用無明顯影響。達(dá)到消毒低有效濃度增加一倍以上或短作用時(shí)間延長一倍以上者可視為有明顯影響。

附錄E

乙型肝炎表面抗原破壞試驗(yàn)

(補(bǔ)充件)

E1內(nèi)容提要

　　乙型肝炎表面抗原(HBsAg)破壞試驗(yàn)是以HBsAg的抗原活性為間接標(biāo)志，評價(jià)消毒因子對乙型肝炎病毒(HBV)滅活能力的試驗(yàn)方法。

　　適用于評價(jià)化學(xué)消毒劑、紫外線對HBV的消毒效果。

E2  試劑

E2.1  小牛血清(56℃，30min滅活)。

E2.2  0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2～7.4)。

E2.3  純化HBsAg(1.0mg/mL)。

E2.4  固相放射免疫分析法試劑，要求特異性100%，精密性CV≤15%，靈敏度≤1.0ng/mL，線性r＞0.95。

E2.5  酶聯(lián)免疫吸附法試劑，要求特異性100%，精密性CV≤15%，靈敏度≤3.2ng/mL，線性r＞0.95。

E3  器材

E3.1  吸量器：包括試管、吸管(0.1，1.0，5.0和10.0mL4種)和微量進(jìn)樣器(100.0μL)。

E3.2  載體(直徑1.5cm大小的不銹鋼片)。

E3.3  免疫計(jì)數(shù)儀。

E3.4  酶聯(lián)免疫測定儀。

E⒊5  低溫冰箱(—30℃～—70℃)。

E4  HBsAg懸液的配制

E4.1  取0.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)9.4mL加入小牛血清0.6mL，配成含6%小牛血清的懸液。再取該P(yáng)BS 9.0mL，加入濃度為1.0mg/mL的純化HBsAg懸液1.0mL，使成含5.4%小牛血清，HBsAg濃度為100μg/mL的試驗(yàn)用HBsAg懸液。

E4.2  將試驗(yàn)用HBsAg懸液1.0mL盛裝入容量為1.5mL的玻璃安瓿中，封口，放-30℃～-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。保存期為三個月。

E5  HBsAg的檢測方法

E5.1  固相放射免疫分析法(SPRIA)。

E5.2  酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。

E6  中和劑選擇

在測定消毒劑對HBsAg的破壞效果時(shí)，應(yīng)先選出適宜的中和劑及其使用濃度，再進(jìn)行破壞試驗(yàn)。

　　所用中和劑：a.應(yīng)能有效而及時(shí)中止消毒劑的殘余作用；b.中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對HBsAg的抗原活性沒有影響，亦不影響檢測方法對HBsAg檢出的靈敏度。

E6.1  將消毒劑用無菌蒸餾水配成不同濃度，取1.2mL消毒液與0.3mLHBsAg懸液混勻，置20±2℃水浴條件下，作用10min，測定該消毒劑10min抑制或破壞HBsAg抗原性的低有效濃度。

E6.2  取消毒劑10min抑制或破壞HBsAg抗原性的低有效濃度與待選中和劑進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)可按下列組別進(jìn)行：a.消毒液0.9mL+HBsAg懸液0.1mL；b.消毒液0.4mL+HBsAg懸液0.1mL作用10min后+含20%小牛血清的中和劑0.5mL；c.先取含20%小牛血清的中和劑1mL與消毒液1mL，混勻，作用10～30min，制成中和產(chǎn)物溶液，再行試驗(yàn)。中和產(chǎn)物溶液0.9mL+HBsAg懸液0.1mL；d.含10%小牛血清的PBS0.9mL+HBsAg懸液0.1mL；e.含10%小牛血清的中和劑0.9mL+HBsAg懸液0.1mL；f.中和產(chǎn)物溶液0.9mL+PBs0.1mL。經(jīng)檢測只有在c、d、e組HBsAg活性的測定值相近(相差10%以下)并都明顯多于b組，a組HBsAg活性不能檢出或檢出活性明顯少于b組，f組陰性對照正常，方可證明所選中和劑及其使用劑量是適宜的。

E6.3  進(jìn)行消毒試驗(yàn)時(shí)，依據(jù)消毒劑與中和劑等當(dāng)量中和原則，適當(dāng)調(diào)整中和劑的用量。再次按E6.2步驟測定中和效果后，方可進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。

E7  破壞試驗(yàn)方法

E7.1  懸液法

　　懸液法指將HBsAg在懸液中與消毒劑相互作用并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的試驗(yàn)方法。

E7.1.1  HBsAg懸液的濃度為檢測試劑靈敏度的104倍。如檢測試劑的靈敏度為1ng/mL，HBsAg的濃度應(yīng)為10μg/mL。

E7.1.2  取含5%小牛血清的PBS2.7mL加到含0.3mL濃度為100μg/mL的HBsAg懸液中，混勻。

E7.1.3  取小牛血清20mL加到含80mL滅菌的中和劑溶液中，混勻。

E7.1.4  破壞試驗(yàn)：將預(yù)定消毒液濃度1.25倍的消毒液與HBsAg懸液按4∶1比例混合，混合液容量不少于1.5mL。然后置20±2℃水浴條件下，作用達(dá)規(guī)定時(shí)間，即刻取0.3mL混合液與等體積含20%小牛血清的中和劑混勻，作用10～30min，取樣測定殘留HBsAg的活性，每一樣本平行測定2份，每份0.1mL，取其平均值，判定破壞效果。每種消毒劑觀察3個濃度，每一濃度觀察4個作用時(shí)間。試驗(yàn)重復(fù)5次。

E7.1.5  陽性對照：取含20%小牛血清的中和劑1mL，加到含1mL試驗(yàn)用消毒液的試管中混勻，作用10～30min，制成中和產(chǎn)物溶液。取該中和產(chǎn)物溶液0.9mL加入試驗(yàn)濃度的HBsAg懸液0.1mL取樣檢測，每一樣本檢測3份，每份0.1mL，取其平均值為陽性對照值。

E7.1.6  陰性對照：取含20%小牛血清的中和劑1mL加到含1mL試驗(yàn)用消毒液的試管中，混勻，作用10～30min，取樣檢測，每一樣本檢測3份，每份0.1mL取其平均值為陰性對照值。

　　應(yīng)注意陰性對照不能用試劑盒的陰性對照樣本。

E7.2  載體法

　　載體法指將在載體表面的HBsAg與消毒因子相互作用，并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的試驗(yàn)方法。

E7.2.1  HBsAg載體的制備

E7.2.1.1  載體為直徑1.5cm大小的不銹鋼片，經(jīng)洗滌劑煮沸洗滌脫脂、壓力蒸汽滅菌備用。

E7.2.1.2  HBsAg懸液的濃度為檢測方法靈敏度的5×104倍。如靈敏度為1ng/mL，HBsAg的濃度應(yīng)為50μg/mL。

E7.2.1.3  HBsAg的污染方法為滴染法。滴染時(shí)，將滅菌載體平鋪于無菌平皿內(nèi)，用微量進(jìn)樣器吸取HBsAg懸液，滴注于載體*，每個載體20μL。然后用L型白金絲將懸液涂布均勻，放37℃培養(yǎng)箱40～60min，待懸液干燥后進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。

E7.2.2  抗原性破壞試驗(yàn)

　　取污染HBsAg的載體，平放于無菌平皿內(nèi)，用吸管吸取預(yù)定濃度的消毒液50μL，滴注于載體*，迅即涂勻，使整個載體均勻受藥。每2片一組，置20±2℃水浴中，作用規(guī)定時(shí)間后，用無菌鑷子將載體移入含1.0mL10%小牛血清的中和劑試管中。作用10～30min，敲打振蕩200次，取樣檢測殘留HB-sAg的活性，每一樣本取樣2份，每份0.1mL，取其平均值，判定抗原性的破壞效果。每種消毒劑觀察3個濃度，每個濃度觀察4個作用時(shí)間。試驗(yàn)重復(fù)5次。

　　在觀察紫外線破壞HBsAg的效果時(shí)，將污染載體直接置作用因子下，作用規(guī)定劑量后將載體移入含1.0mL10%小牛血清PBS的試管中，敲打振蕩200次，取樣檢測殘留HBsAg活性，每一樣本取樣2份，每份0.1mL，取其均值，判定破壞效果。試驗(yàn)重復(fù)5次。

E7.2.3  陽性對照

　　在觀察消毒劑破壞HBsAg效果時(shí)，取50μL試驗(yàn)用消毒液加到含1.0mL10%小牛血清中和劑的試管中，作用10～30min，制成中和產(chǎn)物溶液。取該中和產(chǎn)物溶液1.0mL加到大試管中，然后將滴染HB-sAg的載體移入，敲打振蕩200次，每一樣本檢測3份，每份0.1mL，取其平均值為陽性對照值。

　　在觀察紫外線破壞HBsAg效果時(shí)，將污染HBsAg的載體直接移入含1.0mL10%小牛血清的PBS(PH7.2～7.4)的試管中，敲打振蕩200次，每一樣本檢測3份，每份0.1mL，取其平均值為陽性對照值。

E7.2.4  陰性對照

　　在觀察消毒劑破壞HBsAg效果時(shí)，取50μL消毒液加到含1mL 10%小牛血清中和劑試管中，作用10～30min，取樣檢測，每一樣本檢測3份，每份0.1mL。取其平均值為陰性對照值。

　　在觀察紫外線破壞HBsAg時(shí)，陰性對照則為含10%小牛血清的PBS(pH7.2～7.4)。每一樣本檢測3份，每份0.1mL，取其平均值為陰性對照值。

　　應(yīng)注意陰性對照不能用試劑盒的陰性對照樣本。

E8  破壞效果判定

　　以S/N＜2.1作為HBsAg抗原性破壞合格標(biāo)準(zhǔn)。其中S是消毒因子作用后被檢樣品或陽性對照樣品平均每分鐘脈沖數(shù)(cpm)值或光密度(OD)值。N是試驗(yàn)中陰性對照樣品平均cpm值或OD值。

　　附加說明：

　　本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國衛(wèi)生部提出。

　　本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)*流行病學(xué)微生物學(xué)研究所負(fù)責(zé)起草。

　　本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人袁洽劻、王太星、顧健。

　　本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托技術(shù)歸口單位衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室負(fù)責(zé)解釋。