Weatern blot原理
蛋白質(zhì)印跡（Western Blot，WB）又稱為免疫印跡（Immunoblot），其是利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將樣品中分子量大小不同的蛋白分開，然后通過電轉(zhuǎn)移的方法將凝膠中的蛋白幾乎原位、定量地遷移、固定到固相膜上，再利用抗原、抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)以及特殊的抗體標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)而對(duì)目的蛋白進(jìn)行定性、相對(duì)定量檢測(cè)的技術(shù)。
常見問題
Q
蛋白提取后可以存放多久？
A：
蛋白提取后-80℃可保存一年。建議分裝保存，避免反復(fù)凍融。
Q
蛋白提取時(shí)用進(jìn)行超聲破碎嗎？
A：
一般建議進(jìn)行超聲處理，這樣可使樣本裂解更充分，對(duì)于核蛋白、核染色質(zhì)相關(guān)蛋白等難提取、復(fù)雜的蛋白，超聲處理是關(guān)鍵因素。
Q
做組織樣品蛋白的WB的時(shí)候，提取蛋白
有什么特別注意的嗎？
A：
必須進(jìn)行研磨、勻漿處理，做超聲處理，使蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分。組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要加入抑制蛋白酶活性的抑制劑，防止蛋白降解。
Q
蛋白含量測(cè)定方法的選擇？
A：
提取的樣品中若含有去垢劑則需要選用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，若樣品中含有螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類等，則需要選用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。
Q
WB實(shí)驗(yàn)中樣品上樣量是多少？
A：
細(xì)胞裂解物或組織勻漿的總蛋白的上樣量一般為20-40μg，純化蛋白的上樣量一般為10-100ng。
Q
WB實(shí)驗(yàn)中一般需要多少個(gè)細(xì)胞？
A：
一般5×106足夠。但要看是哪種細(xì)胞，有的細(xì)胞的體積就很小，而有的細(xì)胞則鋪得很開。常規(guī)做WB一個(gè)孔道上樣要105個(gè)細(xì)胞。但也和目的蛋白及提取的方式有關(guān)。如果是膜蛋白或是某細(xì)胞器內(nèi)分布的蛋白細(xì)胞數(shù)得增多。
Q
電泳后為什么會(huì)出現(xiàn)“微笑”或
“倒微笑”條帶？
A：
a)“微笑”是因?yàn)楣嗄z的時(shí)候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。
b)“倒微笑”現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時(shí)電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不*，加APS和TEMED后應(yīng)該混合均勻。
c)電泳和轉(zhuǎn)膜溫度過高，點(diǎn)樣量太多或每孔點(diǎn)樣量不均勻，電泳電壓不穩(wěn)定或過高都可能引起條帶不整齊的現(xiàn)象。
Q
轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)？
A：
a)濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙≥膜≥膠。
b)濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。
c)保持膜的濕潤，若FVDF膜干燥，需要重新用甲醇活化。
Q
脫脂奶粉和 BSA 封閉有區(qū)別嗎？
A：
一般來講，BSA 會(huì)產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，因?yàn)?BSA 含有較少的蛋白，抗體與之發(fā)生交叉反應(yīng)的概率較低。但并非總是如此，有些抗體在脫脂奶粉中的封閉效果更好，因?yàn)槊撝谭壑泻懈喾N類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質(zhì)。
Q
一抗二抗用什么稀釋？
A：
一抗可用封閉液稀釋。二抗可用TBST稀釋，若感覺背景高也可以用封閉液進(jìn)行稀釋。若使用商品化的WB抗體稀釋液，則需要注意稀釋液中是否還有防腐劑（NaN3），若含有則不能稀釋HRP標(biāo)記二抗。
Q
目的蛋白分子量為何與實(shí)際不符？
A：
a)翻譯后修飾：蛋白發(fā)生如磷酸化、糖基化等翻譯后修飾時(shí)分子量會(huì)增加；
b)翻譯后剪切：蛋白發(fā)生剪切時(shí)分子量會(huì)降低，某些蛋白在合成時(shí)是作為前提蛋白合成的，然后剪切形成活性形式；
c)剪切異構(gòu)體：同一基因經(jīng)不同剪切方式可能產(chǎn)生不同大小的蛋白；
d)多聚體：比如蛋白二聚化；
e)電泳，膠濃度，蛋白Marker等因素也會(huì)影響實(shí)際蛋白分子量的判斷。
Q
內(nèi)參抗體的選擇？
A：
a)內(nèi)參與目的蛋白分子量相差5KD以上
b)不同組織樣本在選擇內(nèi)參時(shí)存在一定差別
Q
WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果條帶很弱或者無目的條帶
A：
Q
WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果非特異性條帶多
A：
Q
WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果背景偏高
A：
Q
WB實(shí)驗(yàn)中其他常見的問題
A：
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