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α-酮戊二酸（α-KG）含量檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號：BC5420

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑三：臨用前加入3.34mL蒸餾水充分溶解。未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

2、 試劑四：臨用前加入0.5mL蒸餾水充分溶解。未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

3、 標準品：臨用前加入0.856mL蒸餾水充分溶解，配制成80μmol/mL α-酮戊二酸標準溶液，2-8℃可保存4周。

4、 試劑四工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑四：蒸餾水=0.1mL：0.4mL（共0.5mL，10T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5、 400nmol/mL標準溶液配制：實驗前取50μL的80μmol/mL標準溶液，加入950μL蒸餾水充分混合配制成4μmol/mL標準溶液。再取100μL 4μmol/mL標準溶液和900μL蒸餾水混合配制成0.4 μmol/mL（400nmol/mL）標準溶液備用。

產(chǎn)品說明：

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）是三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產(chǎn)物，是連接細胞內(nèi)碳-氮代謝的關鍵節(jié)點。α-酮戊二酸作為一種短鏈羧酸分子，是谷*酰胺、谷*酸等多種重要的氨基酸的前體，不僅直接參與供能，還參與細胞內(nèi)多種化學反應，具有多種生理作用。

GDH催化NH₄⁺、α-酮戊二酸和NADH，生成谷*酸和NAD⁺，引起340nm吸光度下降。通過測定NADH的變化，計算α-酮戊二酸含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/金屬浴/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

2. 細胞：按照細胞數(shù)量（10⁶個）：提取液一體積（mL）為5~1：1的比例（建議5百萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

3. 液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，12000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，用蒸餾水調零。

2、 加樣表：（在1mL比色皿中加入下列試劑）

三、α-酮戊二酸（α-KG）含量計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

α-KG含量(nmol/mg prot) = C_標準× (ΔA_測定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_標準-ΔA_空白)×V_樣÷ (Cpr×V_樣)×F

= 400×(ΔA_測定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_標準-ΔA_空白)÷Cpr×F

(2) 按樣本質量計算

α-KG含量(nmol/g 質量) = C_標準×(ΔA_測定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_標準-ΔA_空白) × (V_上清+V_提取液二)÷ (W×V_上清÷V_提取液一)×F

= 475×(ΔA_測定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_標準-ΔA_空白)÷W×F

(3) 按細菌或細胞數(shù)目計算

α-KG含量(nmol/10⁶ cell) = C_標準×(ΔA_測定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_標準-ΔA_空白)×(V_上清+V_提取液二)÷(N×V_上清÷V_提取液一)×F

= 475×(ΔA_測定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_標準-ΔA_空白)÷N×F

(4) 按液體體積計算

α-KG含量(nmol/mL) = C_標準×(ΔA_測定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_標準-ΔA_空白)×(V_上清+V_提取液二)÷[V_液體×V_上清÷(V_液體+V_提取液一)]×F

= 5225×(ΔA_測定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_標準-ΔA_空白)×F

C_標準：α-酮戊二酸標準溶液濃度，400 nmol/mL；V_樣：反應體系中加入的樣本體積，0.3mL；V_上清：提取時上清的體積，0.8mL；V_提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V_提取液一：加入提取液一的體積，1mL；V_液體：液體樣本體積，0.1mL；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細胞或細菌數(shù)目，以10⁶計；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 如果樣本A1_測定＜A1_空白或?A_測定大于0.8，可以用蒸餾水對樣本進行稀釋或者縮短第二步37℃反應時間；如果?A_測定小于0.01，可以加大樣本量或者延長第二步37℃反應時間。最終計算時同步修改計算公式。

2. 提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。

3. 溫度對該實驗影響較大，務必保持反應溫度在37℃。

實驗實例：

1、 稱取0.1066g小鼠肝臟組織進行樣本處理，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA_測定=A1_測定-A2_測定=1.201-1.175=0.026，ΔA_標準=A1_標準-A2_標準=1.015-0.487=0.528，ΔA_空白=A1_空白-A2_空白=1.080-1.074= 0.006。帶入公式計算：

α-KG含量（nmol/g 質量）=475×(ΔA_測定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_標準-ΔA_空白)÷W×F =170.72 nmol/g 質量

參考文獻：

[1] Azmi N E, Ahmad M, Abdullah J, et al. Biosensor based on glutamate dehydrogenase immobilized in chitosan for the determination of ammonium in water samples[J]. Analytical Biochemistry, 2009, 388(1):28-32.

[2] Fei Ding, Qiannan Hu, Meiling Wang, et al. Knockout of SlSBPASE Suppresses Carbon Assimilation and Alters Nitrogen Metabolism in Tomato Plants. International Journal of Molecular Sciences. December 2018;(IF4.183)

[3] Lin Y, Nan J, Shen J, et al. Canagliflozin impairs blood reperfusion of ischaemic lower limb partially by inhibiting the retention and paracrine function of bone marrow derived mesenchymal stem cells[J]. EBioMedicine, 2020, 52: 102637  

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