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異檸檬酸含量檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號：BC5950

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二工作液：臨用前先離心，根據(jù)樣本量按試劑二：蒸餾水=10μL：90μL（共100μL，約1T）的比例配制后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2、 試劑三：臨用前加入4 mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1 mL蒸餾水充分溶解成20μmol/mL異檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品。

4、 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑一：試劑二工作液：試劑三=750μL：100μL：50μL（共900μL，約1T）配成工作液后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說明：

異檸檬酸（Isocitric Acid）是檸檬酸的異構(gòu)體，在許多水果和蔬菜以及由這些原料制成的食品中發(fā)現(xiàn)了大量的異檸檬酸鹽。生物能夠利用的是D型異檸檬酸，是三羧酸循環(huán)中的一個成分。異檸檬酸在異檸檬酸脫氫酶（ICDH，EC1.1.1.41）的作用下變成a-酮戊二酸，同時NAD（P）還原為NAD（P）H，據(jù)此可以計算異檸檬酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、1mL石英比色皿、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體的操作步驟請見“產(chǎn)品資料"文件

注意事項(xiàng)：

1.最好兩個人同時做此實(shí)驗(yàn)，一個人比色，一個人計時，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.若樣本ΔA<0.005，可適當(dāng)增大樣本量后測定；若樣本ΔA>1.2或A測定>1.5，可用蒸餾水稀釋上清液后測定，

注意同步修改計算公式中的稀釋倍數(shù)。

3.提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定，如需測定蛋白濃度，需另取組織。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1139g蘋果加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（0.241-0.125）-（0.066-0.059）=0.109，帶入標(biāo)曲y=0.1414x-0.0466，R²=0.9991，計算x=1.100，按樣本質(zhì)量計算異檸檬酸含量得：

異檸檬酸含量（μmol/g 質(zhì)量）=1.1875×x÷W×F=11.468 μmol/g 質(zhì)量。

2、 取0.1033g橙子葉加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（1.001-0.923）-（0.066-0.059）=0.071，帶入標(biāo)曲y=0.1414x-0.0466，R²=0.9991，計算x=0.832，按樣本質(zhì)量計算異檸檬酸含量得：

異檸檬酸含量（μmol/g 質(zhì)量）=1.1875×x÷W×F=19.129 μmol/g 質(zhì)量。

3、 取500μL橙汁飲料取上清后按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得ΔA測定=（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）=（0.856-0.840）-（0.066-0.059）=0.009，帶入標(biāo)曲y==0.1414x-0.0466，R²=0.9991，計算x=0.393，按液體體積量計算異檸檬酸含量得：

異檸檬酸含量（μmol/mL）=x×F=0.393 μmol/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kvasni Ka, Franti Ek, et al. "Determination of Isocitric Acid in Citrus Juice—A Comparison of HPLC, Enzyme Set and Capillary Isotachophoresis Methods." Journal of Food Composition & Analysis 15.6(2002):685-691.

[2] Kong, Min Jung, et al. "Mitochondrial NADP⁺-dependent isocitrate dehydrogenase deficiency increases cisplatin-induced oxidative damage in the kidney tubule cells." Cell Death & Disease 9.5(2018):488.

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