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isoCell是英國(guó)iotaSciences公司推出的一款基于GRID專利技術(shù)（專利號(hào)：WO2019197373A1）的高通量、高自動(dòng)化的單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)。isoCell采用微射流技術(shù)，利用界面張力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基（或干細(xì)胞涂層）進(jìn)行重塑，在培養(yǎng)皿上雕刻出單獨(dú)的細(xì)胞腔室GRID（可以在6厘米培養(yǎng)皿上創(chuàng)建256個(gè)單細(xì)胞腔室陣列），并將細(xì)胞自動(dòng)地分配到各個(gè)單細(xì)胞腔室中。
相比于傳統(tǒng)方法的低效與高消耗，isoCell僅需極少量的培養(yǎng)基與試劑，自動(dòng)將細(xì)胞分選至腔室，通過(guò)自帶的光學(xué)顯微鏡可以清楚地看到腔室中的細(xì)胞，以確保分選出的細(xì)胞100%為單細(xì)胞。isoCell可將單細(xì)胞在GRID中培養(yǎng)成單克隆細(xì)胞系，培養(yǎng)過(guò)程中可以根據(jù)客戶需求進(jìn)行換液操作，全流程可視化監(jiān)控以確保每個(gè)單細(xì)胞克隆均來(lái)自所挑選的單個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)完成后可自動(dòng)收獲單克隆細(xì)胞系。
通過(guò)isoCell單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化、高效率的細(xì)胞系構(gòu)建、CRISPR-Cas9基因編輯等功能。
設(shè)備特點(diǎn)
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自動(dòng)化的單細(xì)胞分選，培養(yǎng)至細(xì)胞克隆并收獲
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自動(dòng)化的單細(xì)胞識(shí)別及全腔室圖像記錄
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操作條件溫和，有效維持細(xì)胞活性，確保細(xì)胞克隆高存活率
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全觸屏控制，系統(tǒng)引導(dǎo)完成整個(gè)工作流程
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自動(dòng)轉(zhuǎn)移至PCR管或96孔板
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自動(dòng)生成每個(gè)細(xì)胞克隆的克隆性報(bào)告
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兼容多種試劑
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主要應(yīng)用
細(xì)胞系構(gòu)建
單細(xì)胞克隆是開(kāi)發(fā)穩(wěn)定細(xì)胞系的關(guān)鍵步驟，這一過(guò)程需要進(jìn)行詳盡的記錄和驗(yàn)證，以確保最終細(xì)胞系的身份、穩(wěn)定性及一致性。通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞池后，分離單細(xì)胞并將其培養(yǎng)成克隆群體至關(guān)重要。isoCell的特有的單細(xì)胞培養(yǎng)腔室便于進(jìn)行可靠的單克隆性驗(yàn)證，包括全腔室圖像及相關(guān)記錄。所有繁瑣的移液操作均自動(dòng)化進(jìn)行，簡(jiǎn)化了流程并確保了過(guò)程的一致性。建立的單克隆細(xì)胞系將經(jīng)過(guò)后續(xù)多種測(cè)試，評(píng)估其生長(zhǎng)特性和目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。
CRISPR-Cas9基因編輯
在建立基因編輯細(xì)胞的過(guò)程中，單細(xì)胞克隆是整個(gè)工作流程中最大的挑戰(zhàn)。CRISPR-Cas9編輯細(xì)胞池建立后，分離單細(xì)胞并將其培養(yǎng)成克隆群體至關(guān)重要。初始細(xì)胞池中同時(shí)包含編輯和非編輯細(xì)胞，因此分離步驟必不可少。傳統(tǒng)的手動(dòng)單細(xì)胞克隆方法繁瑣且難以確保單克隆性，isoCell的單細(xì)胞培養(yǎng)腔室能夠輕松可靠地驗(yàn)證單克隆性，解決了上述問(wèn)題，同時(shí)將所有移液操作自動(dòng)化，簡(jiǎn)化了流程并確保了一致性。
應(yīng)用案例
人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）敲除/單核苷酸多態(tài)性（SNP）敲入的優(yōu)化CRISPR實(shí)驗(yàn)方案
本文提出了一種優(yōu)化CRISPR-Cas9方案，用于在人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）中高效實(shí)現(xiàn)基因敲除（KO）或單核苷酸多態(tài)性（SNP）敲入（KI）。該流程整合了基因組靶向設(shè)計(jì)、CRISPR遞送、編輯效率評(píng)估和自動(dòng)化單細(xì)胞克隆分離技術(shù)，顯著提高了基因編輯的成功率和克隆存活率。研究人員采用isoCell自動(dòng)化平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離，顯著提升了克隆篩選的效率和準(zhǔn)確性。
完成轉(zhuǎn)染的hiPSCs經(jīng)過(guò)編輯效率驗(yàn)證后，使用isoCell進(jìn)行單細(xì)胞克隆分選。以下步驟描述的是針對(duì)一個(gè)細(xì)胞克隆GRID（包含256個(gè)獨(dú)立腔室）的接種過(guò)程，預(yù)期細(xì)胞克隆存活率不低于40%。
采用isoCell優(yōu)化的細(xì)胞克隆方法，在256個(gè)腔室的GRID中，接種當(dāng)天可計(jì)數(shù)到平均70個(gè)含有單細(xì)胞的小室（圖A），其中平均有46個(gè)克隆存活，存活率可達(dá)65%。對(duì)于22種不同的iPSC細(xì)胞系的32個(gè)基因位點(diǎn)的KO score和KI score評(píng)分，最低的評(píng)分分別為15和10（圖B）。但由于相對(duì)較高的克隆效率，一塊GRID也能夠獲得多達(dá)5個(gè)克隆。
參考文獻(xiàn)：
Ludwik, K. A., Telugu, N., Schommer, S., Stachelscheid, H., & Diecke, S. (2023). ASSURED-optimized CRISPR protocol for knockout/SNP knockin in hiPSCs. STAR protocols, 4(3), 102406.
《Cell》膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）通過(guò)表觀遺傳免疫編輯獲得骨髓相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序以引發(fā)免疫逃逸
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）在基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳層面上表現(xiàn)出高度的腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性。GBM與腫瘤免疫微環(huán)境之間的相互作用在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。然而，GBM如何促進(jìn)腫瘤免疫微環(huán)境的機(jī)制仍然不清楚。英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)再生醫(yī)學(xué)中心的Steven M. Pollard團(tuán)隊(duì)[1]通過(guò)體外試驗(yàn)和動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（glioblastoma stem cell, GSC）通過(guò)表觀遺傳途徑進(jìn)行免疫編輯，促進(jìn)髓系細(xì)胞的招募，形成富含髓系細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
本文中研究者使用iotaSciences的單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)isoCell分選并培養(yǎng)了NPE-IE Irf8敲除細(xì)胞，隨后構(gòu)建了相應(yīng)的細(xì)胞系。NPE-IE Irf8敲除細(xì)胞系的腫瘤發(fā)展動(dòng)力學(xué)與移植了NPE-IE細(xì)胞的小鼠相似，證明Irf8的激活是NPE-IE細(xì)胞免疫逃逸的重要因素，并且這種激活可能通過(guò)體內(nèi)的IFNγ信號(hào)介導(dǎo)。
這項(xiàng)研究揭示了GBM細(xì)胞在受到免疫攻擊后，通過(guò)表觀遺傳重組和髓系特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，增強(qiáng)TME的免疫抑制性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。這為監(jiān)測(cè)免疫治療過(guò)程中GBM細(xì)胞的免疫逃逸及制定新的免疫治療策略提供了新的思路，對(duì)于在GBM中發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳免疫編輯過(guò)程是否也適用于其他腦瘤或癌癥，將具有重要意義。
參考文獻(xiàn)：
[1]. Gangoso, E., Southgate, B., Bradley, L., Rus, S., Galvez-Cancino, F., McGivern, N., ... & Pollard, S. M. (2021). Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion. Cell, 184(9), 2454-2470.
測(cè)試數(shù)據(jù)
人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)的單細(xì)胞克隆
人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)構(gòu)建單克隆細(xì)胞系培養(yǎng)步驟繁瑣，細(xì)胞對(duì)異常的處理和操作非常敏感，傳統(tǒng)單細(xì)胞分選容易導(dǎo)致細(xì)胞和遺傳毒性應(yīng)激的積累，進(jìn)而導(dǎo)致不良分化和多能性喪失。使用isoCell可以溫和且自動(dòng)化地將人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)進(jìn)行單細(xì)胞分選，并高效地培養(yǎng)hiPSCs單克隆細(xì)胞系，顯著提高了細(xì)胞分離與克隆效率（如下圖所示）。
HEK293單克隆細(xì)胞培養(yǎng)
對(duì)人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSCs) Prime 編輯構(gòu)建工程細(xì)胞系
Prime 編輯可在 HEK3 基因座中高效精確插入三個(gè)核苷酸，用于構(gòu)建工程細(xì)胞系hiPSCs。通過(guò)引入靶標(biāo)特異性 pegRNA 來(lái)編輯單個(gè)或多個(gè)基因組位點(diǎn)，以進(jìn)行精確有效的基因組編輯，促進(jìn)疾病建模和功能遺傳學(xué)研究。
Prime 編輯使用與逆轉(zhuǎn)錄酶融合的 Cas9 切口酶，將 DNA 序列從“Prime 編輯”引導(dǎo) RNA (pegRNA) 復(fù)制到特定基因座。通過(guò)Prime 編輯將多西環(huán)素誘導(dǎo)型 Prime Editor 蛋白 (PE2) 整合到 iPSC 細(xì)胞系的AAVS1 基因組，之后使用isoCell分選轉(zhuǎn)入靶基因的hiPSCs細(xì)胞系，以確保細(xì)胞的單克隆性。（見(jiàn)上圖）
該研究使用isoCell來(lái)確保工程細(xì)胞系的單克隆性與準(zhǔn)確性。
參考文獻(xiàn)：
Bharucha N, Ataam J A, Gavidia A A, et al. Generation of AAVS1 integrated doxycycline-inducible CRISPR-Prime Editor human induced pluripotent stem cell line[J]. Stem Cell Research, 2021, 57: 102610.
發(fā)表文章
1. Fahy, K., Kapishnikov, S., Donnellan, M., McEnroe, T., O'Reilly, F., Fyans, W., & Sheridan, P. (2024). Laboratory based correlative cryo-soft X-ray tomography and cryo-fluorescence microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy V, 293.
2. Fahy, K., Weinhardt, V., Vihinen-Ranta, M., Fletcher, N., Skoko, D., Pereiro, E., ... & McEnroe, T. (2021). Compact Cell Imaging Device (CoCID) provides insights into the cellular origins of viral infections. JPhys Photonics, 3(3).
3. Kapishnikov, S., Hempelmann, E., Elbaum, M., Als‐Nielsen, J., & Leiserowitz, L. (2021). Malaria pigment crystals: The achilles′ heel of the malaria parasite. ChemMedChem, 16(10), 1515-1532.
4. Kapishnikov, S., Staalsø, T., Yang, Y., Lee, J., Perez-Berna, A. J., Pereiro, E., ... & Als-Nielsen, J. (2019). Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 116(46), 22946-22952.
5. Kapishnikov, S., Leiserowitz, L., Yang, Y., Cloetens, P., Pereiro, E., Awamu Ndonglack, F., ... & Als-Nielsen, J. (2017). Biochemistry of malaria parasite infected red blood cells by X-ray microscopy. Scientific reports, 7(1), 802.
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